초록 ▼

1) 배아 줄기세포의 miRNA-mRNA 네트워크 분석
● miRNA는 AGO 단백질과 결합하여 5’ 부위의 6 ~ 8 nucleotide로 이루어진 seed sequence와 상보성이 있는 mRNA의 translation을 억제함. 이론상 하나의 miRNA가 수백 개의 mRNA를 조절할 수 있음으로 그 기능을 파악하기 위해서는 시스템적 분석이 필요함.
● AGO2와 결합한 RNA를 분석함으로써 세포내 miRNA에 의해 조절되는 mRNA를 분석하고자 선행 연구에서 수립한 flag-AGO2 배아줄기세포를 분석에 이용함.

1) 배아 줄기세포의 miRNA-mRNA 네트워크 분석
● miRNA는 AGO 단백질과 결합하여 5’ 부위의 6 ~ 8 nucleotide로 이루어진 seed sequence와 상보성이 있는 mRNA의 translation을 억제함. 이론상 하나의 miRNA가 수백 개의 mRNA를 조절할 수 있음으로 그 기능을 파악하기 위해서는 시스템적 분석이 필요함.
● AGO2와 결합한 RNA를 분석함으로써 세포내 miRNA에 의해 조절되는 mRNA를 분석하고자 선행 연구에서 수립한 flag-AGO2 배아줄기세포를 분석에 이용함.
● flag tag이 부착된 형태의 AGO2를 발현하는 배아줄기세포를 UV로 공유결합을 유도한 후 flag에 대한 항체를 이용하여 분리하여 결합하고 있는 RNA를 분석하는 CLIP-seq (CrossLinking Immunoprecipitation/High throughput sequencing)을 수행함.
● 배아줄기세포에는 miR-302-367 cluster 의 miRNA가 전체의 약 2/3를 차지함. CLIP-seq data 분석을 통해 이들 miRNA가 결합하는 부위 약 5000개를 파악하고, 이들 miRNA가 target과 결합하는 방식에 대한 자료를 제시함.
● miRNA의 target들이 조절하는 pathway를 분석하여 줄기세포성 유지에 miRNA의 역할을 제시하였으며, 그 중 Wnt signaling pathway가 이들 miRNA에 조절됨을 확인함.
● 배아줄기세포에 miR-367에 대한 저해제를 처리 후 CLIP-seq을 수행하고 예측된 miR-367의 결합을 확인함으로써 miR-367의 target들을 확인하고 추후 같은 방법으로 miRNA의 타겟을 검증할 수 있음을 증명함.

2) 분화된 세포의 miRNA-mRNA 네트워크 분석
● 배아줄기세포를 섬유아세포, 심근세포, 신경세포로 분화시킨후 IP-seq을 수행하여 miRNA의 프로파일링에 효과적임을 확인함. CLIP-seq 분석을 통해 miRNA-mRNA 네트워크 분석을 수행함.
● 섬유아세포 분석을 통해 암억제 miRNA인 let-7, 암 유도 miRNA인 miR-17-92에 의해 조절되는 암 관련 pathway를 분석하고 새로운 발암 기전을 제시함.
● let-7을 발현하지 않는 배아줄기세포에 let-7을 도입한 후 CLIP-seq을 수행함으로써 let-7 target을 확인함. 이를 섬유아세포의 분석 결과와 비교함으로써 높은 신뢰도로 let-7을 확인하였음.

3) AGO2의 endonuclease activity에 의한 발현 조절
● miRNA에 의한 발현 조절을 매개하는 AGO1~4 중 AGO2는 endonuclease activity가 있어 siRNA의 경우에서와 같이 완벽히 상보적인 타겟을 절단함. 그러나 miRNA와 완벽히 상보적인 결합을 이루는 타겟은 극소수에 불과해 세포내에서 기능에 대해 의문이 제기되어 왔음.
● 섬유아세포의 CLIP-seq 분석을 통해 완벽히 상보적이지 않은 다수의 타겟이 AGO2에 절단됨을 확인하였으며, 절단이 가능한 타겟의 경우 그렇지 않은 경우보다 발현이 더욱 감소함을 확인하였음.
● 절단된 부분에서 nontemplated nucleotide addition을 확인하였음. 이는 siRNA에 의해 절단될 때도 나타나는 현상이며 절단된 RNA의 빠르게 제거하는데 관여하는 것으로 알려져 있음. 따라서 AGO2에 의한 mRNA의 절단이 비교적 광범위하게 일어나지만 절단후의 불안정성으로 인해 지금까지 발견하지 못하였던 것으로 사료됨.

(출처 : 연구결과 요약문 3p)