초록 ▼

본 연구에서는 국소화된 표면 플라즈몬 공명(LSPR) 기술과 무세포 단백질 발현 기술의 융합을 통하여 유전자에 입력된 서열 정보를 고속으로 단백질의 형태로 번역함과 동시에 발현되는 단백질을 실시간으로 분석할 수 있는 비표지 및 in situ 분석 플랫폼을 구축하고, 유용단백질들의 동시 발현 분석 및 이들의 활성 스크리닝을 고속으로 구현 할 수 있는 기술 개발을 목적으로 연구를 수행 하였다.

1차년도에는 무세포 단백질 발현 시스템과 PCR 기법을 이용한 단백질 발현의 최적화 및 LSPR 센서 제작을 위한 연구를 수행하였다

본 연구에서는 국소화된 표면 플라즈몬 공명(LSPR) 기술과 무세포 단백질 발현 기술의 융합을 통하여 유전자에 입력된 서열 정보를 고속으로 단백질의 형태로 번역함과 동시에 발현되는 단백질을 실시간으로 분석할 수 있는 비표지 및 in situ 분석 플랫폼을 구축하고, 유용단백질들의 동시 발현 분석 및 이들의 활성 스크리닝을 고속으로 구현 할 수 있는 기술 개발을 목적으로 연구를 수행 하였다.

1차년도에는 무세포 단백질 발현 시스템과 PCR 기법을 이용한 단백질 발현의 최적화 및 LSPR 센서 제작을 위한 연구를 수행하였다. 먼저 목적 유전자 합성을 위해 2 step-PCR 기법을 이용하여 발현율이 높은 단백질들의 초기 코돈 도입 등 발현율 및 활성을 높이기 위한 연구를 통해 고 발현 및 고 활성 단백질을 찾고자 하였다. 이러한 방법은 본 연구에서 사용한 모델 단백질(Green fluorescence protein; GFP)뿐만 아니라 유용 단백질의 발현율 향상을 위해 적용 될 수 있으리라 판단된다. 또한, LSPR 센서 제작을 위해 금 나노 로드(gold nanorod; GNR)를 합성하고, histidine tagging된 목적 단백질의 비표지 및 in situ 분석을 위해 GNR을 Ni-NTA로 수식화하고 제작된 LSPR 센서(GNR-NTA-Ni conjugate; GNR probe)에 정제된 목적 단백질을 농도별로 처리하여 GNR probe의 작동 여부를 확인 할 수 있었다.

2차년도에는 하이드로겔을 이용한 발현 단백질의 구조적 안정화 향상 및 LSPR 센서와 무세포 발현 기술의 융합 연구를 위해 1차년도에 제작한 GNR probe를 고정할 하이드로겔을 선정하고 고정된 GNR probe 상에서 단백질 발현 여부를 peak shift를 통해 확인 하였다. Agarose gel-LSPR 센서 칩 상에 무세포 단백질 합성 mixture와 목적 유전자를 loading하고 발현을 시도 하였다. 발현된 histidine tagging 된 단백질들은 근처에 있는 GNR-NTA-Ni(GNR probe)에 고정이 되고 GNR 표면에 고정된 단백질들로 인해 LSPR peak shift가 일어나게 된다. 단백질의 발현 정도에 따른 peak shift로 실시간 발현 모니터링뿐만 아니라 고정된 단백질들은 수화된 3D 구조의 agarose gel 상에서 활성을 유지 하면서 고정되어 있어 어 고 활성의 단백질을 합성 할 수 있었고, 단백질의 안정화 및 고정화 효율을 높일 수 있었다. Agarose gel상에서 단백질 합성을 시도 하고 발현되는 목적 단백질 외의 비특이 반응을 줄이는 실험을 수행 하였다. 무세포 단백질 합성 mixture 조성 중에 세포 파쇄액 (extract)은 단백질 발현에 필요한 단백질들이 농축 되어 있어서 GNR probe와 agarose gel 농도 및 세척 조건을 통해 반응 조건 최적화 실험을 수행 하였다. 모델 단백질로 EGFP를 선정하고 이를 gel 내에서 발현하고 peak shift와 형광 비교를 통해 발현 여부를 비교 분석 할 수 있었다.

3차년도에는 agarose gel-LSPR 센서 상에서 발현 단백질의 활성 분석 및 단백질 간의 상호 작용 분석을 통한 단백질 칩으로의 활용 범위 확장을 시도하였다. 모델 단백질로 luciferase 그리고 C-reactive protein single chain variable fragment (CRP scFv)를 발현하고 이들의 활성 및 단백질 상호 작용 분석을 수행 하였다. 먼저 단백질의 동시 발현 분석을 위해 96 well plate 및 glass 기판에 어레이 칩을 제작하고 칩 상에서 여러 종의 단백질의 in situ 합성을 시도하고 LSPR peak shift에 따른 동시 분석을 수행 하였다. Luciferase 발현 후 LSPR peak shift와 luminescence 세기를 비교 분석하고, CRP scFv 발현 후 GNR에 고정 여부 확인 후 CRP를 처리하여 LSPR peak에 따른 비표지 분석을 확인 하였다.

본 과제에서는 단백질 발현과 분석을 하나의 플랫폼으로 융합 하여 기존의 단백질 칩 기술과 달리 in situ 단백질 합성 및 비표지 분석을 통한 다종의 단백질을 발현과 동시에 빠르게 분석 할 수 있는 방법을 개발 하였고, 이는 단백질 공학, 의약용 단백질 스크리닝, 바이오 센싱 소자 개발에 많은 기여를 할 것으로 기대된다.

(출처 : Ⅰ. 연구결과 요약문 4p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 3
• Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 4
• Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 5
• 1. 연구과제의 개요 ... 5
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 5
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 5
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 8
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 8
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 8
• Ⅲ. 연구성과 ... 8
• 끝페이지 ... 11