[보고서]각막재생을 위한 줄기세포 분화제어 바이오나노융합기술개발

강길선

각막재생을 위한 줄기세포 분화제어 바이오나노융합기술개발
Development of Bio-Nano Fusion Technology on Stem Cell Differentiation for Regeneration of Cornea 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	전북대학교 Chonbuk National University
연구책임자	강길선
참여연구자	이동원 , 송정은 , 김은영 , 이소진 , 장지은 , 전대연 , 조선아 , 김혜윤 , 이현구 , 이천중 , 박진영 , 양재원 , 나민주 , 신재훈 , 이선의 , 장나금 , 차세롬 , 정현기 , 차재근 , 김창현 , 주천기
보고서유형	1단계보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2015-08
과제시작연도	2014
주관부처	미래창조과학부 Ministry of Science, ICT and Future Planning
등록번호	TRKO201800008127
과제고유번호	1711020008
사업명	바이오·의료기술개발
DB 구축일자	2018-05-19
키워드	각막내피세포.각막세포분화.실크기재나노지지체.각막재생.바이오나노융합기술.역분화 줄기세포.각막 줄기세포.분화.교차분화.분화 기전.분화 조절인자.Corneal endothelial Cell.Differentiation.Smart silk nano scaffold.Corneal regeneration.Bio-nano fusion technology.iPS.Corneal Stem cell.Differentiation.Direct conversion.Differentiation mecahnism.Differentiation regulator.iCS.
DOI	https://doi.org/10.23000/TRKO201800008127

초록 ▼

● 실크기반 지지체 제작 기술 확립
● 5 μm 이하의 이식체 제작 방법 확립
● 분화 프로토콜 확립 (직접/간접/조건배지 배양 시스템)
● 골드나노파티클 및 메탈 파티클 합성법 확립
● iPSC를 이용한 각막 줄기세포/각막 상피세포 분화 기술 구축
● 3차원 배양시스템을 이용한 각막상피조직 형성 분석을 통한 각막줄기세포 기능 검증
● 이식이 가능한 지지체 획득 및 이식 프로토콜 확립
● 각막 이식 모델을 이용, iPSCs로부터 분화 유도된 세포층이 있는 지지체 이식 및 각막 체세포를 이용한

Abstract ▼

Ⅳ. Research and Development Results
· Establishment of technique for fabricating transparent silk scaffold to construct artificial corneal endothelium (Casting, Electrospinning, Patterning) : Modifying/improving fabricated silk fibroin film surface characteristics (by chemical treatment, plasam, extracellular matrix, synthetic materials), Development of less 5 μm thickness of silk based scaffold with duck feet's derived collagen (Applying domestic/PCT patents)
· Establishment of protocols (Direct/indirec/conditioned medium systems) for differentiation from stem cells to corneal endothelial like cells to obtain enough corneal endothelial cells to regenerative corneal endothelium
· Constructing corneal stem cell/corneal epithelial cell differentiation technology using iPSC (Publishing paper and applying paptent)
· Investigation of corneal stem cell functions by studying formation of corneal epithelial tissue through 3-d culture system
· Establishment of transplantation protocol and obtaining transplantable scaffold to corneal model animals
· Obtaining direct iCS technology using corneal somatic cell and transplantation of scaffold with induced cell layer from iPSCs

(출처 : SUMMARY 5p)

목차 Contents

표지 ... 1
제 출 문 ... 2
보고서 요약서 ... 3
요 약 문 ... 4
SUMMARY ... 5
CONTENTS ... 6
목차 ... 7
제1장 연구개발과제의 개요 ... 8
1절. 연구개발의 개요 ... 8
2절. 연구개발대상 기술의 중요성 및 연구개발의 필요성 ... 8
제2장 국내외 기술개발 현황 ... 14
1절. 세계적 수준 ... 14
2절. 국내수준 ... 16
제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 18
제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 33
1절. 연구개발 목표 및 내용 ... 33
2절. 연구개발목표의 달성도 ... 33
제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 40
제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 42
제7장 연구시설·장비 현황 ... 47
제8장 참고문헌 ... 48
끝페이지 ... 51

표/그림 (25)

표 줄기세포의 연도별 과학사적 발견
표 각막 질병 및 장애
표 국내의 각막 이식 현황
표 국내기증자의 나이 분포
표 바이오각막 재생을 위한 생체재료의 최적 디자인
표 다양한 제조방법에 따른 실크세포지지체의 형태
표 A) 직접/간접/조건배지 시스템을 통해 각막내피세포화 비교 A) 세포의 형태적 변화 B) N-cadherin,Zo-1, Na+/K+-ATPase 등의 단백질 발현 확인 및 C) 마커 mRNAs 발현 비교
표 A) 실크 탈검 모식도 B) 2차원 지지체 C) 3차원 지지체 D) 투명도 측정결과 E) 제작된 실크 필름의 표면 특성과 필름의 성분 분석 비교 (LSS : 6% 세리신 포함 실크 지지체, HSS : 9% 세리신 포함 실크 지지 체) F) 표면 친수성 결과 G) 인장강도 결과
표 A) 배양된 각막내피세포의 특이적 모폴로지 유지 확인 B) HSS 지지체에 파종된 세포의 특성 유지 확인 (왼:H&E 염색, 오른:핵염색) C) 초기 부착도 D) 증식률 평가 E) 각막내피세포의 마커 유전자 발현 및 F) 기 능 단백질 발현확인
표 A) 추출된 DC의 SDS-PAGE 결과 (S: standard, D: Duck feet collagen) B) 제작된 초박막 오리발콜라겐/실크피 브로인 필름의 육안관찰 결과 C) 투명도 평가 D) 표면의 친수성 평가 E) 필름의 표면, 단면 모폴로지 관찰 결과 F) 오리발콜라겐/실크피브로인 초박막 필름에서 배양된 각막내피세포의 증식률 평가
표 A) 오리발콜라겐/실크/젤라틴 필름의 육안관찰 결과 B) 표면 모폴로지 관찰 결과 (FESEM) C) 필름의 두께 D) 면역형광염색을 통해 초박막 콜라겐/실크 피브로인 수용액 필름에서 배양된 세포의 ZO-1 발현 확인
표 A) 전기방사법으로 제작된 실크 피브로인 매트 육안관찰 결과 B) 전기방사 지지체의 모폴로지 및 두께 C) 전기방사 실크 지지체에서 배양된 각막내피세포의 표현형 유지 D) 증식률 비교 (전기방사 지지체 vs. 필름) E) 전기방사 실크 지지체에서 배양된 각막내피세포의 기능성 단백질 발현 확인 (Red: ZO-1, Green:Na+/K+-ATPase)
표 A) 합성된 ZnO의 특성 분석 (a) FESEM 결과, (b) TEM 결과, (c) EDX 결과 B) 합성된 ZnO 나노파티클의 화학적 특성 분석 (a) XRD, (b) FTIR, (c) room-temperature photoluminescence of ZnO nanoparticles
표 A) 고체배지에 ZnO 나노파티클과 함께 처리된 박테리아 (a) E. coli, (b) S. aureus 의 성장곡선 B) 박테리아의 Live and dead staining 결과 (Green : FITC, Red : PI) C) ZnO 나노파티클의 처리 농도에 따른 (a) A549 세포의 세포 활성도와 (b) Live and dead staining 결과 (Green : FITC, Red : PI)
표 A) 처리된 ZnO 나노파티클의 농도에 따른 각막내피세포의 생존률 평가 (왼) 형태적 변화 (오른) 증식률 결과 B) PEG/ZnO 나노파티클과 ZnO 나노파티클 처리에 따른 각막내피세포 증식률 비교 결과 C) 각막 내피세포에 의한 PEG/ZnO 나노파티클의 uptake 분석 결과
표 윤뷰조직 배양
표 Side population 분포
표 Wnt3a 처치 조건하에서 각막 윤부 배양 (A, B). (C) RT-PCR결과 각막 윤부 및 각막 상피세포 분화 마커인 ABCG2, p63과 CK3가 Wnt3a배양 조건하에 증가
표 알카리 화상 동물 모델에서 이식후 1주, 2주간 관찰 (A, B, K, L, M) Control groups (C, D, H, I, J) ex vivo corenal epithelial collagen sheet 이식 (1주~2주), (E, F) Acellular collagen sheet 이식
표 iPSC를 각막상피세포배지(CEpi-M) 및 각막윤부세포 배지(PI)에 14일간 배양한 후 colony 가장자리로부터 분화된 세포들이 관찰됨
표 iPS를 각막상피세포배지(CEpi-M) 및 각막윤부세포 배지(PI)에 14일간 배양한 후 RT-PCR(상)과 realtime PCR (하) 시행함.
표 iPS세포에 PI배지 및 분화촉진인자 가능성이 있는 여러 단백질 (BMP4,WNT3a, WNT4, WNT5a)을 각각 추가하여 14일간 배양 후 콜로니 가장자 리로부터 분화된 세포들이 관찰됨
표 PI 배지에 여러 분화촉진인자를 추가한 후 14일 뒤 콜로니 가장자리의 분화된 세포들을 분리하여 qPCR 시행하였을 때 BMP4 처치시 윤부줄기세포 마커들이 증가하는 경향을 보였음
표 교차분화를 이용한 수정체상피세포로부터 신경줄기세포주 제작
표 교차분화의 검증

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