초록 ▼

□ 연구목표
- 인체 혈관, 특히 심장 관상동맥과 중뇌동맥 혈관근육세포를 부검 검체에서 분리, 획득

- 이로부터 전사체 스크리닝을 통한 관상동맥경화증 및 허혈성 심장질환에 특징적인 바이오마커를 발굴, 데이터베이스화 하며,

- 이를 동물모델 및 급성심장사 부검례에 적용, 최적의 바이오마커 조합을 발굴, 검시 실무영역에 활용코자 함.

□ 연구내용
○ 1년차 확정 유전자의 혈관근육세포에서 역할 구명
- 유전자 발현 조절 세포주 구축 및 생물학적 의미 분석
: Cldn11 유전자는

□ 연구목표
- 인체 혈관, 특히 심장 관상동맥과 중뇌동맥 혈관근육세포를 부검 검체에서 분리, 획득

- 이로부터 전사체 스크리닝을 통한 관상동맥경화증 및 허혈성 심장질환에 특징적인 바이오마커를 발굴, 데이터베이스화 하며,

- 이를 동물모델 및 급성심장사 부검례에 적용, 최적의 바이오마커 조합을 발굴, 검시 실무영역에 활용코자 함.

□ 연구내용
○ 1년차 확정 유전자의 혈관근육세포에서 역할 구명
- 유전자 발현 조절 세포주 구축 및 생물학적 의미 분석
: Cldn11 유전자는 혈관근육세포에서 발현됨을 확인 할 수 있었음.
: siRNA-Cldn11 처리에 따른 CLDN11 발현 위치 변화. (A) 생식세포에서 대표적인 tight junction protein으로 알려진 CLDN11은 혈관근육세포에서는 세포막 또는 세포질에서 모두 발현하였음. 이에 대한 결과는 occludin, ZO-1과 같은 다른 tight juction protein과의 co-staining으로 확인할 필요가 있음. (B) siRNA 처리 후 CLDN11 발현은 세포막 주위의 CLDN11은 거의 소실되었지만 세포질, 특히 핵 주위에서는 발현정도가 증가하는 것으로 관찰되었음.

: siRNA-Cldn11 처리에 따른 혈관근육세포의 증식에 미치는 영향. Matrigel을 이용한 tube formation assay에서, 대조군(control)에 비하여 siCldn11 처리군은 조기에 활발한 tube formation을 촉진함을 알 수 있었음. 즉 CLDN11 knockdown은 혈관근육세포의 분화보다는 증식에 영향을 주는 것으로 판단되었음. 또한, CLDN11 siRNA 처리 후 G1-S phase가 대조군 대비 약 21% 증가하는 것을 확인할 수 있었음.

: Microarray 분석을 통한 Cldn11 knockdown이 혈관근육세포에 미치는 영향 분석.
총 450개의 유전자가 siRNA-Cldn11 처리에 따라 변화를 하였으며 이중 130개는 up-regulation, 320개는 down-regulation되었음. Gene ontology 분석에서는 특히 angiogenesis, cell migration, inflammatory response, aging, 그리고 cell proliferation에 관한 유전자의 변화를 동반하였음.

○ 신규 확보된 유력 전사체 부검조직 내 발현 확인
- 신규 발굴 전사체의 부검 검체 발현 고찰
: 허혈성심장사 (20례), 비허혈성심장사 (10례), 비심인성급사 (10례) 대상
- 확정 유전자의 법의진단 적용 및 최우선 대사체 확정
: 좌관상동맥 전하행지 (left ant. descending a., LAD)와 중뇌대동맥 (middle cerebral artery, MCA)를 대상으로 한 유전자 발현 스크리닝. 대상 유전자 중 ApoD, Clan11, 그리고 Notch3의 발현은 LAD에 비하여 MCA에서 유의하게 높은 것을 확인 할 수 있었음.

: qRT-PCR을 통한 동맥경화증 진행에 따른 Notch1, Notch3, Hes1, Hes5, Cldn11, 그리고 ApoD 유전자 발현 확인 (I). Cldn11의 경우 LAD와 MCA모두에서 Grade I(Nonatherosclerotic intimal lesions)에 비하여 Grade II (Progressive atherosclerotic lesions) & Grade III (Lesions with acute thrombi)에서 유의하게 그 발현이 감소하였음(p=0.0026, 0.0027). 그러나, Grade II와 Grade III 사이에서는 모든 대상 유전자 발현에서 유의한 차이를 확인할 수 없었음. 이러한 결과는 Cldn11의 발현은 혈관 근육세포의 항상성 유지에 관여를 하며, 이의 감소는 atherosclerosis initiation & propagation에 관여하는 것으로 추정됨.

연구성과(응용분야 및 활용범위포함)
- 1, 2년차 연구에서 발굴한 각종 유전자들은 기존의 혈관질환 (관상동맥질환, 뇌혈관 질환)에서 전혀 연구가 되어 있지 않은 인자들임. 따라서 이들의 혈관질환 및 급성심장사에서의 역할 연구들은 in vitro 또는 제한적 동물도델에서 제시된 기존의 질병 개념 및 그 조절기전과 다를 수 있을 것으로 사료됨.

- 따라서 본 연구 결과는 지속적인 지원이 이루어질 경우, 질병 병태생리의 이해에 결정적인 단서가 될 수 있으며, 이들은 기존의 형태학적 방법으로 판단하지 못했던 사망의 원인 및 사망의 종류를 기능적으로 판단할 수 있는 보조자료로 활용 될 수 있을 것임

- 새로운 진단 기법의 개발로 기존의 방법에 추가하여 사망의 원인이나 사망의 종류의 진단에 효율성을 높일 수 있는 자료 및 한국인 대상 Bio-Chip 개발에 활용 될 수 있을 것임

- 법의검체를 활용한 제한적 연구가 아닌, 인체 질병 발병 장소의 병태생리를 이용함으로써 급증하고 있는 심혈관질환 예방을 위한 국가적 데이터 베이스 구축 사업 기반자료로 활용

- Circulatome을 넘어 인체 유래 조직 big data 기반 질병역학연구의 시발점이 될 것으로 사료됨

(출처 : 총괄연구과제요약 29p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 용역연구과제 연차실적·계획서 ... 2
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 당해연도 연구 실적 ... 6
• 1. 연구의 필요성 ... 6
• 2. 연구과제의 최종 연구목표와 당해연도 연구목표 ... 10
• 3. 연구과제의 당해연도 연구내용 및 방법 ... 11
• 4. 연구과제의 당해연도 연구결과 및 고찰 ... 13
• 5. 연구과제의 당해연도 연구성과 ... 23
• 6. 연구수행에 따른 문제점 및 대책 ... 28
• 7. 실적 요약문 ... 29
• 차기연도 연구과제 계획 ... 32
• 총괄연구과제 ... 33
• 1. 요약문 ... 33
• 2. 차기연도 연구비 총괄표 ... 34
• 3. 차기연도 연구목표 및 내용 ... 35
• 4. 차기연도 연구 추진전략·방법 및 추진체계 ... 41
• 5. 차기연도 연구 결과의 활용방안 및 기대성과 ... 42
• 끝페이지 ... 44