초록 ▼

□ 핵심기술
뮤코닉산 합성을 위한 새로운 유전자를 발굴하여 산업화에 적합한 생산 안정성을 갖춘 세계 최고 수준의 고생산성 뮤코닉산 생산균주 및 생산공정의 개발

□ 최종목표
E.coli와 함께 고생산성 아로마틱 아미노산 생산균주인 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)에 대하여 바이오매스 유래의 발효당을 이용하여 TPA 전구체인 뮤코닉산(cis,cis-muconic acid)을 대량으로 생산할 수 있는 재조합균주를 제작·개량하고, 비교평가를 통하여 최종 뮤코닉산 생산균주를

□ 핵심기술
뮤코닉산 합성을 위한 새로운 유전자를 발굴하여 산업화에 적합한 생산 안정성을 갖춘 세계 최고 수준의 고생산성 뮤코닉산 생산균주 및 생산공정의 개발

□ 최종목표
E.coli와 함께 고생산성 아로마틱 아미노산 생산균주인 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)에 대하여 바이오매스 유래의 발효당을 이용하여 TPA 전구체인 뮤코닉산(cis,cis-muconic acid)을 대량으로 생산할 수 있는 재조합균주를 제작·개량하고, 비교평가를 통하여 최종 뮤코닉산 생산균주를 선발하여, 이 균주에 적합한 최적발효·분리공정 기술을 개발하고자 함.

□ 개발내용 및 결과
1. E.coli 균주 개발의 내용 및 결과
- DHS 생합성과 경쟁 관계에 있는 유전자 제거를 통하여 DHS 생산이 증대된 생산균주 개발 : DHS 81 g/L
뮤코닉산 전구체인 DHS의 생산 증대를 위해 DHS 생합성과 경쟁 관계에 있는 유전자 등 제거할 유전자 대상 선정을 위하여 glucose로부터 aromatic amino acid의 생합성 경로 분석을 통해 aroE, ptsG, tyrR, pykA 그리고 pykF 유전자를 순차적으로 제거하여 각각의 결손균주를 제작함.
5L 발효기 배양 결과, DHS 생산성은 △aroE△tyrR 결손 균주에서 최대 41 g/L, △aroE△tyrR△ptsG 결손 균주에서 최대 74 g/L, △aroE△tyrR△ptsG△pykA 결손 균주에서 최대 81 g/L, △aroE△tyrR△ptsG△pykA△pykF 결손 균주에서 최대 74 g/L의 생산성을 나타냄.
경쟁 관계의 유전자가 결손 될수록 최종산물인 DHS의 생산성이 향상되는 것을 확인 할수 있었으며, pykA까지 결손된 균주에 있어서 최대 DHS 생산성 결과를 얻음.

- 뮤코닉산 생합성 외래유전자가 도입 및 promoter 최적 E.coli 균주 개발
: 뮤코닉산 51 g/L
E.coli AB2834 유래 DHS 생합성과 경쟁 관계 유전자 제거 변이균주에 뮤코닉산 생산 aroZ, aroY, catA 외래유전자 도입 균주 개발에 있어서 최적의 오페론 시스템을 구축하고 동시에 뮤코닉산 생산성 향상을 위하여 lac promoter 외에 새로운 promoter개발 전략을 통해 oppA 및 fusA promoter를 확보하여 Lac promoter 보다 생산성이 10% 향상된 결과를 얻음. 이를 통하여 5L 발효기 배양 결과 뮤코닉산 51g/L의 생산성 결과를 얻음.

- DHS 생합성 경로상에 있는 유전자의 발현 강화를 통한 DHS 생산 증대 변이균주 개발 및 뮤코닉산 생산 증대 : DHS 120 g/L, 뮤코닉산 64.5 g/L
DHS 생합성 경로 상의 aroGFBD 유전자 및 glucose transporter 유전자 galP, ppsA를 chromosome 내로 integration 시켜 유전자를 과발현 하여 줌으로써, DHS 생합성 경로의 흐름을 더 빠르고 원활하게 하여 결과적으로 5L 발효기에서 DHS 120g/L 및 뮤코닉산 64.5g/L로 생산성이 매우 향상된 균주를 확보함.
E. coli AB2834 ΔERGA ΔlacI :: Plac_galP_ppsA_Plac_aroG_aroF_ Plac_aroBD /PoppA asbF aroY catA

- 안정적인 뮤코닉산 생산을 위한 뮤코닉산 생합성 외래유전자의 chromosome 내 도입을 위한 최적화 및 안정화된 균주를 확보하기 위한 다양한 시도를 수행.

2. E.coli 에서의 뮤코닉산 생산 배양공정 최적화 및 scale up
- 5L 발효기에서의 배양공정 최적화 : DHS 120 g/L, 뮤코닉산 64.5 g/L 외래유전자 발현 최적화를 위하여 성장배지 및 생산배지의 최적화와 함께 glucose feeding의 적용 시점(induction point), 농도, 공급 속도 등의 다양한 변수의 최적화를 수행. 특히 feeding medium의 배지 최적화 및 공급 전략의 최적화를 통해 DHS 120 g/L, 뮤코닉산 64.5 g/L 결과 확보.
Miniature system 구축을 통해 제작되는 균주의 생리활성 특성을 신속하게 파악.
통계학적 배지 최적화 프로그램을 활용하여 대사산물의 생산을 향상시킬 수 있는 최적배지 screening system을 구축함.

- 뮤코닉산 생산 재조합대장균 균주의 50L, 500L 발효기에서의 배양공정
Scale-up : 뮤코닉산 60 g/L 달성
E. coli AB2834△aroE△tyrR△ptsG△pykA/fusA 균주의 50 L 발효기에서의 뮤코닉산 47 g/L 생산성 확인
E. coli AB2834△aroE△tyrR△ptsG△pykA/△LacI::PLac-galP, ppsA, aroGFBD / oppA 균주의 경우 반복 실험에서 생산 재현성 확인함
E. coli AB2834△aroE△tyrR△ptsG△pykA/fusA 균주의 500 L 발효기에서의 뮤코닉산 60 g/L 생산성 확인

3. C. glutamicum 에서의 뮤코닉산 고생산 균주 개발
- 뮤코닉산 중간대사체 축적 유도를 위한 중간대사체 및 뮤코닉산 분해대사 관련 유전자 제거
aroE gene disruption을 통한 DHS 축적 유도 균주 제작, pcaG 및 pcaH gene disruption을 통한 PCA 축적 유도 균주 제작, 그리고 catB gene disruption을 통한 뮤코닉산의 분해대사 차단을 통해 뮤코닉산 축적이 가능해진 균주 제작
C. glutamicum 13032△aroE△pcaGH△catB

- 뮤코닉산 생합성을 유도할 수 있는 새로운 PCA decarboxylase 외래유전자 도입
뮤코닉산 생합성이 가능한 PCA decarboxylase 외래유전자 발굴과 함께 PCA decarboxylase 외래유전자 발현을 위한 벡터 시스템 구축, 외래유전자 발현을 위한 새로운 발현벡터의 제작을 통해 PCA decarboxylase subunit 유전자를 도입한 균주 확보.
C.glutamicum ATCC13032 △aroE△pcaGH△catB /pSK002_Psod_YBDOPT1

- 뮤코닉산 생합성 경로상에 있는 유전자의 발현 강화를 통한 뮤코닉산 생합성 경로 강화 균주 개발
[인하대 전략]
DHS dehydratase 활성 증가를 위한 qsuB 및 유사 유전자의 추가 도입
PCA 생합성 경로상에 있는 aroG, aroF, aroB 유전자의 발현 강화
뮤코닉산 전구물질로의 PEP와 E4P의 축적을 위한 경로 최적화
DHS의 생산량 증대를 위한 새로운 전략 : tyrR like 유전자 탐색 및 제거

- Glucose 흡수속도 개선과 연계한 뮤코닉산 생합성 경로 강화 균주 개발 [생기원 전략]

4. C.glutamicum 에서의 뮤코닉산 생산 배양공정 최적화 및 scale up
- C.glutamicum ATCC13032 △aroE△pcaGH△catB /pSK002_Psod_YBDOPT1
균주의 배지 최적화 : Flask 배양에서 뮤코닉산 4 g/L
: OFAT, One factor at a time에 의한 탄소원 및 질소원 조사
: Flask에서의 질소원 조합 조사
: FFD(Full Factorial Design)를 통한 생산배지 최적화
: SAM(Steepest Ascent Method)을 통한 생산배지 최적화
: 5L 발효기에서 탄소원과 질소원 비율(C/N ratio) 조사
- 5L 발효기에서의 회분식 배양공정 최적화 : 뮤코닉산 13 g/L
: 성장배지 최적화, 접종량에 따른 최적화 실험(1%, 5%, 10%)
- 5L 발효기에서의 회분식 배양공정 최적화 : 뮤코닉산 40 g/L
: Phosphate limited fed batch
: Ammonium sulfate, (NH4)2SO4 농도에 따른 조사 (1x, 1.4x, 1.8x)
- 50L 발효기에서의 유가식 배양공정 Scale-up : 뮤코닉산 60 g/L
- 500L 발효기에서의 유가식 배양공정 Scale-up : 뮤코닉산 62 g/L
- 5000L 발효기에서의 유가식 배양공정 Scale-up : 뮤코닉산 61 g/L

5. C.glutamicum 에서의 뮤코닉산 생산 연속배양공정 개발
- SLP 공급배지의 무기 질소원조성 변화, 배양온도(30℃) 조절을 통한 연속배양공정에서의 SLP 공급배지의 농축 농도 및 빠른 희석속도는 Wash-out에 대한 위험성이 크고, 세포회수기에서 세포가 농축되기 전에 빠져나가는 단점을 확인하였기 때문에 이를 보완하고자 높은 농도의 배지를 비교적 천천히 공급하면서 좀 더 효과적으로 세포를 회수하고자 높은 농축정도의 SLP 공급배지를 통한 고정된 희석속도와 재순환속도 조건 실험을 통해 뮤코닉산 21 g/L, 부피생산성은 최대 0.26 g/L/hr, 단위세포당 생산성은 최대 0.55g 뮤코닉산/g CELL 확인.
- 연속배양공정 및 세포 재순환 연속배양공정의 생산성 향상 효과를 확인하기 위해서 Reactor Volume Reduction Factor에 의한 세포 재순환 연속배양공정의 평가를 통해 세포 재순환 연속배양공정을 적용하여 회분식 배양공정과 비교하여 동일 양의 뮤코닉산을 생산할 때, 연속배양공정 및 세포 재순환 연속배양공정에서 발효조의 부피를 얼마나 축소할 수 있는지에 대해 평가함.
산업적 규모인 50000L 발효조에 적용하여 예상할 경우, 연속배양공정은 10.7배, 세포 재순환 연속배양공정은 17.6배 규모를 감소시켜도 산업적 규모의 회분식배양과 동일한 뮤코닉산 생산성을 나타낼 수 있을 것이라고 예상되었음.
- 연속배양공정 또는 세포 재순환 연속배양공정의 개발 및 최적화를 통해 비생산적인 시간 뿐만 아니라 초기 투자비용, 공정운영 비용 등을 감소시킬 수 있기 때문에 상업적 생산에 성공한다면 목적산물의 생산단가를 획기적으로 낮출 수 있는 효과가 발생할 것으로 기대됨.

6. 뮤코닉산 분리정제공정 개발
- 본 과제를 통해 개발한 바이오-뮤코닉산 분리정제공정에서 순도 98% 이상(최고 순도 99.5%), 회수율 90% 이상을 달성함
- 제2세부기관인 (주)SK케미칼에 총 31.7 kg의 c,t-MA 백색분말을 전달
- 본 분리정제공정과 기 특허권자 측의 분리정제공정을 비교하여 요약하면 ①c,c-MA를 c,t-MA로 이성화하는 과정에서 순도를 떨어뜨리는 불순물이 생성되지 않고 100% 전환되며, ②c,t-MA의 분리정제공정에서의 높은 회수율(90% 이상)과 함께, ③무기염류 및 색소의 완벽한 제거로 고순도 (98~99.5%)로 c,t-MA를 정제할 수 있으므로 Amyris사와 같이 유기용매를 일체 사용하지 않아 친환경적이고 경제적이므로 본 과제의 전체적인 방향과 부합한다고 할 수 있음.

□ 기술개발 배경
고분자시장은 바이오 유래의 환경친화적 원료의 사용을 요구받고 있으며 이에 따라 Coca-Cola, Pepsi와 같은 거대 음료회사들이 100% 식물 유래의 PET(폴리에틸렌 테레프탈레이트) 개발에 총력을 기울이고 있음.
￮ 한편, PET와 유사한 구조를 가지면서도 독특한 특성을 갖는 PTT(폴리트리메닐렌테레프탈레이트) 역시 잠재력 높은 시장규모를 가질 뿐만 아니라, 연평균 17%의 고성장을 진행중에 있음. 따라서 PET와 같이 PTT 역시, 바이오 유래의 환경친화적 고분자합성이 필요함.
￮ PTT는 현재 석유 유래의 TPA(terephthalic acid)와 바이오 유래의 1,3-PDO와의 축합반응으로 합성됨. 한편, 바이오 유래의 1,3-PDO에 대한 연구가 활발히 진행되는 것에 비해 바이오 유래의 TPA 연구는 전 세계적으로 매우 미비한 형편임.
￮ 특히, 대부분의 TPA(terephthalic acid)에 관한 연구가 석유화학물질을 출발점으로 하고 있음. 따라서 바이오 유래의 환경친화적인 TPA 생산공정을 개발해야 할 당위성이 있음.
￮ 그러나, 아직까지 생물공정을 이용하여 바이오 유래의 탄소원으로부터 직접적으로 TPA를 생합성하는 공정은 존재하지 않음. 따라서 TPA 합성을 위한 바이오 유래의 TPA전구체를 생산하고, 화학합성공정을 통하여 TPA로 전환시키는 것이 합당함.
￮ 현재까지 TPA 합성을 위한 바이오 유래의 전구체로는 isobutanol과 muconic acid가 최적임.
￮ 그러나 iso-butanol의 경우 생산성이 낮고, ABE fermentation을 통하여 생산되기 때문에 부산물로써 acetone, ethanol이 생성되어 분리, 정제에 어려움이 있음. 또한 이미 Gevo 社는 2014년 상업화 생산을 위하여 준비 중이며 관련 특허를 보유하고 있어, 특허 회피가 어려운 상황임.
￮ 뮤코닉산의 경우에는 발효당으로부터 직접적으로 생합성하는 재조합균주가 이미 E.coli를 통하여 개발되었고, 관련 특허를 DRATHS 社와 Genometica 社가 보유하고 있어 기존 특허를 회피하여야 시장 진입이 가능한 힘든 실정이었으나 원천 특허가 소멸되어 가능성이 열려 있음.
￮ 따라서 본 연구진은 뮤코닉산 생산과 관련하여 기존 특허를 회피하기 위해 E.coli와 함께 기존 특허에 저촉이 되지 않는 산업적 생산균주인 Corynebacterium glutamicum에 대해 연구를 함께 진행하고 있으며, 본 균주에 뮤코닉산 합성을 위한 새로운 유전자를 발굴하여 DRATHS 社의 생산성 이상의 고생산성 뮤코닉산 발효공정을 개발하고자 함.
￮ 현재 자연상태에서 글루코스와 같은 당으로부터 뮤코닉산을 합성하는 미생물은 알려져 있지 않으며 따라서 인공적인 생합성 경로의 도입이 필요함. 가장 대표적인 생합성 경로는 방향족 아미노산 합성에 이용되는 시키메이트 경로(shikimate pathway)를 활용하는
. 뮤코닉산 인공 생합성 경로는 시키메이트의 전구체인 DHS(3-dehydroshikimate)로 부터 세 개의 효소 즉, DHS dehydratase, protocatechuate decarboxylase,catechnol 1,2-dioxygenase 를 이용하여 뮤코닉산으로 전환시킬 수 있음. 또한 뮤코닉산의 축적을 위해서는 DHS 이후 시키메이트 경로의 차단이 필요함. 대장균, 클렙시엘라(Klebsiella)에서 유사한 경로를 이용하여 뮤코닉산을 생산하는 연구가 이루어졌으며, 생산성 향상을 위해 PTS 기반 글루코스 섭취, 해당작용(glycolysis), PP 경로(pentose phosphate pathway), 시키메이트 경로, 방향족 아미노산 생합성 조절기작을 대상으로 한 최적화가 이루어졌음. 유사한 생합성 경로를 바탕으로 효모를 이용한 뮤코닉산 생산도 시도되었으나 박테리아 기반 시스템과 비교하여 낮은 생산성을 보였으며,이는 해당 미생물에서 관련 대사경로들이 보다 엄격하게 조절되기 때문이 것으로 추측됨.
재조합균주 및 유가식 배양(fed-batch fermentation)을 통해 상당량의 뮤코닉산이 생산되었으나 여전히 생산성 향상의 여지가 있는 것으로 판단됨. 시키메이트 경로 차단에 따른 아미노산 의존성은 배양배지 가격 상승에 따른 생산성 악화를 초래할 수 있는 만큼 부분적인 경로 활성화가 대안이 될 수 있을 것임. 또한 인공 합성경로 구축을 위해 도입된 외래유전자의 발현 향상을 위한 보다 다양한 promoter의 조사 및 도입되는 외래유전자의 보다 광범위한 스크리닝, 반응 메커니즘에 대한 보다 심도있는 이해 및 효소공학을 통한 활성 증대, 부산물 생합성 경로의 차단, 생산된 뮤코닉산의 세포외 분비개선 등이 추가적인 생산성 향상을 위해 고려되어야 할 것으로 판단됨.

□ 핵심개발 기술의 의의
￮ 본 과제를 통해 개발한 바이오-뮤코닉산 생산 균주는 기존의 발효당으로부터 직접적으로 생합성하는 재조합균주가 이미 E. coli를 통하여 개발되었고,관련 특허를 DRATHS 社와 Genometica 社가 보유하고 있어 기존 특허를 회피하여야 시장 진입이 가능한 힘든 실정이었으나 원천 특허가 소멸되어 가능성이 열려 있는 실정임.
￮ 본 과제에서는 뮤코닉산 생산과 관련하여 기존 특허를 회피하기 위해 E.coli와 함께 기존 특허에 저촉이 되지 않는 산업적 생산균주인 Corynebacterium glutamicum에 대해 연구를 진행하여, 신규 생산균주를 확보하였음.
￮ 특히 뮤코닉산 생산 균주 개발에 있어서 뮤코닉산 및 뮤코닉산 전구체의 생합성 강화에 있어서 1차적으로 뮤코닉산 및 뮤코닉산 전구체의 생합성과 경쟁 관계에 있는 유전자의 제거를 통하여 안정적으로 생산성 향상이 이루어진 균주를 순차적으로 개발함으로써 scale-up에 있어서 생산 안정성을 기본적으로 갖추고 있으며, 2차적으로 생합성 경로상에 있는 유전자의 발현 강화에 있어서도 chromosome 내로 integration 시켜 유전자를 과발현 하여 줌으로써 생산성 향상에 있어서 필수적 전제 조건인 생산 안정성을 갖출 수 있었음.
￮ 또한 본 균주에 뮤코닉산 발효공정 및 배지 최적화를 통해 기 발표된 논문 및 기존 특허 이상의 생산성을 확보하여, 세계 최고 수준의 생산성을 확보하였음.
￮ 또한 꿈의 생산기술이라고 할 수 있는 연속배양공정 및 세포 재순환 연속배양공정의 가능성을 확인함으로써, 향후 상업적 생산에 성공한다면 회분식배양방식에 비하여 산업적 생산 규모에 있어서 연속배양공정은 10.7배, 세포 재순환 연속배양공정은 17.6배 규모를 감소시켜도 동일한 생산성을 나타낼 수 있을 것으로 기대됨.
￮ 본 과제를 통해 개발한 바이오-뮤코닉산 분리정제 공정에서는 회수율 90%이상, 순도 98~99.5%를 달성함으로써 기존 특허 기술 보다 우수한 기술을 개발 및 확보하였음.

□ 적용 분야
￮ 뮤코닉산은 다양한 화합물 합성을 위한 전구체로 이용될 수 있으며 특히 PET, PTT 등의 단량체인 테레프탈산(terephthalic acid) 및 나일론(nylon-6,6)의 단량체인 아디프산(adipic acid)의 전구체로서 최근 주목받고 있음.

( 출처 : 최종보고서초록 - 3. 개발결과 요약 5p )

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 최종보고서 초록 ... 3
• 기술개발사업 주요 연구성과 ... 16
• 제 1 장 서론 ... 22
• 제 1 절 과제의 개요 ... 22
• 제 2 장 과제 수행의 내용 및 결과 (기술개발 내용 및 방법) ... 24
• 제 1 절 최종 목표 및 평가 방법 ... 24
• 제 2 절 단계 목표 및 평가 방법 ... 26
• 제 3 절 연차별 개발 내용 및 개발 범위 ... 27
• 제 4 절 수행 결과의 보안등급 ... 51
• 제 5 절 유형적 발생품(연구시설, 연구장비 등) 구입 및 관리 현황 ... 52
• 제 3 장 결과 ... 54
• 제 1 절 연구개발 최종 결과 ... 54
• 제 2 절 연구개발 추진 체계 ... 60
• 제 3 절 고용 창출 효과 ... 63
• 제 4 절 자체보안관리진단표 ... 64
• 제 4 장 사업화 계획 ... 65
• 제 1 절 시장 현황 및 전망 ... 65
• 제 2 절 사업화 계획 ... 66
• 제 3 절 향후 추가 기술 개발 계획(개발기술 응용 등) ... 68
• 부 록 : 5장. 최종 연구결과 및 내용 ... 70
• 끝페이지 ... 354