보고서 정보
주관연구기관 |
농림축산검역본부 Animal and Plant Quarantine Agency |
연구책임자 |
조성준
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참여연구자 |
배유찬
,
권혁만
,
박석찬
,
송혜순
,
이희수
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2017-12 |
과제시작연도 |
2017 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
연구관리전문기관 |
농림축산검역본부 Animal and Plant Quarantine Agency |
등록번호 |
TRKO201800042132 |
과제고유번호 |
1545014852 |
사업명 |
농림축산검역검사기술개발 |
DB 구축일자 |
2018-10-20
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키워드 |
육계.골격계질병.세균성질병.등온증폭법.진단메뉴얼.Broiler.Skeletal diseases.Bacteria.LAMP.Diagnose manual.
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201800042132 |
초록
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o제1세부과제명: 국내 육계의 골격계(다리관절) 질병 원인 조사
- 2012년 ~ 2016년 까지의 최근 5년간 닭에서의 질병 조사 자료 분석 실시
○ 총 63건의 골격계 질병 진단
○ 장구균(36건, 41.3%), 대장균(23건, 26.4%), 포도상구균(15건, 17.2%), 기타(13건, 14.9%)
○ 개체시료에 대한 육안적 병변, 해부 및 조직병변 조사 실시
· 임상증상 : 절뚝거림, 파행, 다리 기형, 관절 종창 등
· 부검 소견 : 대퇴골두 부분이 골절되거나 유리연골이 박리, 관절이 종창
o제1세부과제명: 국내 육계의 골격계(다리관절) 질병 원인 조사
- 2012년 ~ 2016년 까지의 최근 5년간 닭에서의 질병 조사 자료 분석 실시
○ 총 63건의 골격계 질병 진단
○ 장구균(36건, 41.3%), 대장균(23건, 26.4%), 포도상구균(15건, 17.2%), 기타(13건, 14.9%)
○ 개체시료에 대한 육안적 병변, 해부 및 조직병변 조사 실시
· 임상증상 : 절뚝거림, 파행, 다리 기형, 관절 종창 등
· 부검 소견 : 대퇴골두 부분이 골절되거나 유리연골이 박리, 관절이 종창되거나 활액낭 저류
· 조직병리 소견 : 대퇴골두의 연골염과 골수염, 관절염 및 심외막염이 관찰됨
- 대퇴골두괴사 원인체 중 장구균의 정량적 분석
○ 총12건, 46개의 대퇴골두 시료에서 혈액 배지와 엔테로코커스 선택배지를 이용하여 장구균을 정량적으로 분석함
○ 장구균의 CFU 값은 높지 않았으며 동일 농장 유래 장구균이라도 개체마다 종이 다른 경우가 관찰됨
- 골격계 질병 발생 농장의 입식부터 출하 시까지 미생물 검색 및 분포 조사
○ 전북 순창 2개 농장, 경북 상주 및 의성 2개 농장 조사
○ 입식 후 2일(4일), 7일(9일), 15일(15일)째 골격계 이상을 보인 육계에서 시료를 채취, 균 분리 및 동정을 실시 함
○ 대장균, 장구균 중 E. faecalis, E. faecium 및 E. hirae의 순으로 분리율이 높게 나타남
- 시기별 육계 시료에 대한 육안적, 해부학적 및 조직병리학적 소견 조사
○ 시기별 육계의 육안적 소견과 조직병리학적 소견의 관련성이 높게 나타남
○ 일부 조직에서는 구간균이나 간균의 집락이 관찰되었으며 이는 분리균과 골격계 질환발생과의 연관성이 높음을 보여주는 것으로 판단됨
- 농가별 입식 초기 총배설강, 사료 및 깔짚, 먼지 등 환경시료로부터 세균 분포 조사
○ 총배설강으로부터 분리한 세균의 분포는 농가별, 사육계사(품종)에 따라 약간의 차이는 있지만 육계 시료에서 분리된 세균과 동일한 세균 분리
○ 사료와 깔짚, 먼지 등의 환경 시료에서는 대장균, 장구균 등의 분리율이 매우 낮음
-육계 골격계 질병분리주의 동정법에 따른 균주명 정확도 비교
○ 16S 유전자 염기서열 분석, Maldi-ToF 분석 및 등온증폭법을 이용한 동정법 비교
· 16S 유전자 염기서열 동정법 대비 등온증폭법이 대장균(44분리주중1주), 장구균(112분리주중4주)에서 더 정확함
○ 등온증폭법을 이용한 미동정 장구균(Enterococcus sp.) 및 포도상구균(Staphylococcus sp.)에 대한 정확한 종명 동정 실시
· 장구균(E. gallinarum)의경우16S법은Enterococcus sp.로만동정되나, LAMP법은E. garllinarum으로동정됨
· 포도상구균(S. lentus, S. cohnii, S. xylosus)의 경우 16S법은 Staphylococcus sp.로만 동정되나 LAMP법은 각 종별로 정확히 동정됨
- 주요 분리균에 대한 virulence gene분포 조사
○ 대장균 및 장구균의 임상시료, 총배설강, 사료, 깔짚, 먼지 시료에 대한 virulenc gene 분포 조사
○ 대장균(5개 병원성 유전자), 장구균(5개 병원성 유전자)에 대해서 조사
· 대장균 – 임상시료(57~84%), 총배설강(29~86%), 먼지(24~76%) 빈도로 병원성 유전자가 검색 됨
· 장구균 – 5종의 병원성 유전자 중 E. faecalis(3개), E. faecium(2개), E. hirae(1개), E. gallinarum(2개), E. avium(0개), E. durans(1개) 병원성 유전자가 검색됨
- 주요분리균에대한약제감수성조사
○ 약제최소저지농도(MIC)를이용한대장균및장구균의약제감수성조사
· 대장균 –15개약제중4개약제에대해내성을나타냄
· 장구균 – 7개 약제 중, E. faecalis(3개), E. faecium(1개), E. hirae(2개), E. gallinarum(2), E. avium(4개) 약제에 대해 내성을 나타냄
◦제2세부과제명: 육계 농장 골격계 주요 세균성질병 진단법 개발 및 진단메뉴얼 작성
- 육계에서 세균성 골격계 질환 주요 원인균으로 판단된 대장균, 장구균(종별 공통유전자) 및 포도상구균(종별 공통유전자)에 대한 등온증폭법을 이용한 진단법 개발
○ 진단 표적 마커 설계
· 목표 세균의 DNA 중 높은 특이성을 지닌 다양한 유전자 확인 및 최적의 타겟 유전자 선정
· 선정된 타겟 유전자들을 토대로 등온증폭에 적합한 최적의 프라이머 6쌍을 각각 디자인함
○ 각 세균을 이용한 등온증폭기술의 특이도 조사
· 기 보고된 primer 및 Bst 효소가 포함된 등온증폭키트를 이용하여 등온증폭 실시
· 반응물의 색 변화와 전기영동을 통해 균주별 특이도 확인
· 유사 종과의 감별을 위해 타 균종 DNA에 대해 특이도 확인
-등온증폭법을 이용한 장구균 및 포도상구균의 주요 종별특이 검출법 개발
○ 개발된 검출법의 특이성 및민감도조사
- 육계 이외의 세균성 골격계 질환 및 바이러스성 골격계 유발 원인체 진단법 개발
○ 등온증폭법을 이용한마이코플라즈마 시노비에, 레오바이러스 특이 유전자 검출
○ 각 원인체별 목적유전자 및 프라이머에 대한 특이성 및 민감도 확인
- 닭의 주요 면역억제 유발 질병 진단법 개발
○ 등온증폭법을 이용한 닭전염성빈혈증 바이러스, 마렉병 바이러스, 세망내피증 바이러스 및 닭전염성 F낭병 바이러스 특이 유전자 검출
○ 각 원인체별 목적유전자 및 프라이머에 대한 특이성 및 민감도 확인
-육계 골격계 질병 진단 매뉴얼 작성
○ 역학사항, 임상증상, 해부 및 부검 소견, 조직병리소견, 미생물 분리 동정 및 정밀검사, virulence gene 검색, 감수성약제가포함된총괄적진단메뉴얼
(출처 : 연구결과 요약 2p)
Abstract
▼
Lameness is a major economic and welfare issue in commercial broiler production worldwide.
The lameness cases reflect the condition known as bacterial chondronecrosis, osteomyelitis, sometimes referred to femoral head necrosis. The true incidence of this disease is unknown in most countries. This
Lameness is a major economic and welfare issue in commercial broiler production worldwide.
The lameness cases reflect the condition known as bacterial chondronecrosis, osteomyelitis, sometimes referred to femoral head necrosis. The true incidence of this disease is unknown in most countries. This study was performed to find the major microbiological causes of lameness and its related diseases in broiler chickens. We investigated the gross lesion, histopathological and microbiological examination from broiler chickens with submitted for diagnosis during 2012~2016 and chickens with lameness problems, feed, litter and dust, in 4 broiler farms. In the diagnostic cases it showed suppurative synovitis, chondronecrosis in growth plate, or suppurative osteomyelitis in femur and tibia. In the broiler farms, E. coli and, Enterococcus sp. were the main isolated bacteria as in the diagnostic cases. No detected the immunosuppressive viruses on the broiler chicken samples. We developed multiplex PCR for detection virulence genes and established 5 kinds of virulence gene detection method against E. coli and 5 kinds of Enterococcus sp. And also performed antibiotic agents susceptibility tests against isolated bacteria. Three kinds of antibacterial agents such as ciprofloxacin showed high resistance against E. coli and 5 kinds of Enterococcus sp.
We developed more rapid, convenient and accurate detection method for detection of E. coli, Enterococcus sp. and Staphylococcus sp. regarded as major bacteria for skeletal diseases of broiler based on loop-mediated isothermal amplification. Specific seven sets of loop-mediated isothermal amplification primers were developed. We confirmed that the LAMP assays did not cross-react with common avian DNA viruses and other several bacteria. Also, the sensitivity could be determined ranging from 2pg/ul to 400fg/ul. Furthermore, the LAMP assays were more accurate than those of 16s sequencing. Therefore, the LAMP can be used as a useful diagnostic tool in skeletal diseases and identification of bacterial agents. We also developed four kinds of immunosuppressive virus such as CIAV, MDV, REV and IBDV in chickens using LAMP methods. The specificity and sensitivity was higher than conventional PCR methods. When used to test clinical samples, the results of the LAMP assays were in 100% agreement with a previously described PCR. Therefore, the LAMP assays are simple, rapid, highly sensitive, and specific methods for diagnosing four immune-suppressive viruses.
We established the detection system for skeletal diseases and identification method for E. coli, Enterococcus sp. and Staphylococcus sp. The system and methods will be used usefully in the regional diagnoses laboratory and poultry producing field.
(출처 : 영문초록 38p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 농림축산검역검사기술개발 연구과제 최종결과보고서 Final Report (FR) ... 2
- Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 5
- 1. 연구배경 ... 5
- 2. 연구최종목표 ... 6
- 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 6
- Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 7
- 1. 재 료 ... 7
- 2. 연구전략 및 방법 ... 7
- Ⅲ. 연구결과 ... 9
- 1. 제1세부과제명 국내 육계의 골격계(다리관절) 질병 원인 조사 ... 9
- 2. 제2세부과제명 육계골격계주요세균성질병진단법개발및진단메뉴얼작성 ... 21
- Ⅳ. 연구결과요약 ... 33
- Ⅴ. 고 찰 ... 36
- Ⅵ. 연구사업 추진상 문제점 및 건의사항 ... 37
- Ⅶ. 주요연구과제 변경사항 ... 37
- Ⅷ. 참고자료 ... 37
- IX. 영문초록 ... 38
- 끝페이지 ... 39
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