초록 ▼

□ 연구의 목적 및 내용
다인성(多因性, multifactorial disease) 질환은 한 가지 증상이나 검사로 진단이 내려질수도 있으나, 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus;SLE)처럼 여러 증상과 혈액표지자들을 종합적으로 평가하여 이루어짐. 다인성 질환들에 대한 유전학적 연구결과만으로는 설명할 수 없는 여러 가지 현상이 있었고, 그 연관성도 기대했던 것만큼 크지 않음. 이러한 사실을 바탕으로 몇몇 문헌과 연구를 통해 후생유전학적 변화의 검출이 이러한 다인성 질환의 특성들을 설명하고 진단에

□ 연구의 목적 및 내용
다인성(多因性, multifactorial disease) 질환은 한 가지 증상이나 검사로 진단이 내려질수도 있으나, 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus;SLE)처럼 여러 증상과 혈액표지자들을 종합적으로 평가하여 이루어짐. 다인성 질환들에 대한 유전학적 연구결과만으로는 설명할 수 없는 여러 가지 현상이 있었고, 그 연관성도 기대했던 것만큼 크지 않음. 이러한 사실을 바탕으로 몇몇 문헌과 연구를 통해 후생유전학적 변화의 검출이 이러한 다인성 질환의 특성들을 설명하고 진단에 응용할 수 있는 도구를 제공할 수 있을 것으로 기대하게 됨. 본 연구의 목표는 SLE에서 진단과 관련된 후생유전학적 표지자를 개발하고, 한국 SLE환자의 발병과 연관되어 있는 카피수 변이가 있는 유전자를 발굴하는 것이며, 이를 위하여 선행 연구로 6명의 SLE환자와 건강대조군의 혈액 DNA를 추출하고, 이들의 DNA methylation level에 차이가 나는 CpG island를 가진 유전자들을 microarray로 선발하였고, 이들 중 유의한 차이가 나는 부위에 대해 또 다른 방법인 methylation single base extension을 사용하여 14명의 SLE환자와 건강대조군에서 검증하였으며 유의한 차이가 나는 DNA methylation 변화 부위의 유전자들을 선별하였음. 본 과제는 이렇게 선발한 유전자들을 100여명 이상의 SLE환자와 100여명 이상의 건강대조군 혈액에서 차이를 규명하고 나아가 다른 나라의 SLE환자와 건강대조군에서도 이러한 차이가 있는지를 확인하였음. 또한 SLE인 일란성 쌍생아에서의 변화 및 건강한 일란성 쌍생아와 이란성 쌍생아에서의 차이를 연구함으로써 이들의 후생유전학적 변화에 유전적인 영향과 환경적인 영향의 상대적인 평가를 목표로 하고 있음.

□ 연구개발성과
1. 해외 SLE환자와 대조군에서 세 유전자 후생유전학적 변화검증
우리나라 SLE 환자에서 유의하게 차이가 있는 epigenetic marks 세 가지에 대하여 미국 SLE 환자와 대조군에서 검증. 미국 UCLA 실험실과 공동연구를 진행하여 SLE환자와 대조군 각각 50 명씩의 혈액 DNA를 이용하여 세 epigenetic marks에 대해 SLE환자에서 대조군에 비하여 유의하게 증가되어있는 후생유전학적 변화를 검증하였음.
2. SLE 환자에서 세 가지 epigenetic mark의 시간에 따른 변화 연구
- SLE 환자 16명의 blood DNA를 two time point에서 모아진 시료들에서 SLE 질환의 진행에 따른 epigenetic change에 대한 변화를 분석하였는데, VHL와 ADA는 시간에 따라 변화가 유의하지 않았으나, CD3Z methylation level은 유의하게 변화한다는 것을 알게 되었음. 이러한 결과는 CD3Z methylation level이 SLE환자의 disease course에서 변화된다는 것을 의미하는 것이다. 이때 사용한 각 환자의 두번 시료 채취 간격은 2년 이상 이었음.
3. 일란성, 이란성 쌍둥이에서의 후생유전학적변화 관찰 및 유전적 경향분석
- DNA methylation정도가 유전하는 지에 대해서는 식물과 하등생물에서는 명확히 밝혀져 있으나, 포유류 특히 사람에서는 그 증거가 명확하지 않다. SLE 질환과 관련이 있는 세 가지 epigenetic mark들의 유전성 여부를 확인하기 위하여 건강인 여자 일란성과 이란성 쌍둥이들에서 세 가지 epigenetic mark들의 정도를 비교하였다. 이들에서 VHL과 ADA의 경우 일란성 쌍둥이에서 유의한 상관성을 보였는데, 이란성 쌍둥이에서는 차이가 없거나 적었다, 그런데 CD3Z methylation의 경우는 일란성 이란성 쌍둥이 모두에서 유의한 상관성을 보이지 않았다. 이러한 결과로부터 VHL과 ADA methylation은 유전성이 더 강한 반면, CD3Z methylation level은 유전적인 영향이 더 적다는 것을 알 수 있었음. SLE discordant twin에서도 이러한 경향은 일치한다는 것을 확인함.
4. CD3Z methylation level이 disease course에 따라 변한다는 결과는 SLE disease activity와의 관련성이 있을 가능성이 있어서 이에 대해 분석하였는데, CD3Z methylation level이 SLE disease activity index와 유의한 상관관계가 있다는 것을 확인할 수 있었음.
5. SLE 환자와 대조군에서 카피수변이 측정
- 카피수의 변화가 SLE 질환과 연관되어 있다는 것이 보고된 유전자들에 대하여 카피수를 측정할 수 있는 mrcPCR 방법을 확립하고, SLE환자와 대조군명에서 카피 수에 차이가 있는지를 validation하는 연구를 수행함.

□ 연구개발성과의 활용계획(기대효과)
- SLE환자의 진단 및 질병활성도의 후생유전학적 표지자와 카피수 변이가 있는 유전자 정보를 제공함으로써 환자의 진단과 치료방침의 결정에 도움을 줄 수 있음.
- 예비결과는 SLE에서 promoter methylation의 정량적인 변화가 있다는 것을 시사 하는 것으로, 자가면역질환의 진단에 후생유전학적 변화를 이용할 가능성을 제시하고 있음. 특히 CD3Z의 promoter methylation의 증가는 SLE에 이환될 위험성에 대한 odds ratio가 약 20으로 지금까지 보고된 유전적인 SNP(single nucleotide polymorphism; 단염기 다형성)변화들에 의한 odds ratio가 1.3-2.6이라는 것과 비교할 때 진단적인 유용성이 있을 것으로 판단하고 있음. 특히 절단값(cutoff value)을 0.6으로 하였을때, 일반인에서 거의 양성이 없는 반면 전신홍반 루푸스환자의 80%정도에서 양성이라는 선행결과를 얻었는데,이는 현재 가장 많이 사용하고 있는 SLE의 진단표지자 중 하나인 anti-ds DNA titer의 변화와 거의 비슷한 변화라고 할 수 있으며, 따라서 진단표지자로서 유용할 가능성이 높다고 할 수 있음.
- 후생유전학적 변화와 SLE 와의 상관관계에 대한 보고가 있으나, 이를 환자군과 대조군으로 나누어 정확히 규명되지는 않은 상태인데 본 연구는 후생유전자적 변화와 SLE와의 상관관계를 규명할 수 있는 최초의 대규모 환자 대조군 연구가 될 것임.
- 또한 후생유전학적 변화가 유전적인 요인과 환경적인 요인에 의해 결정된다고 알려져 있으나 어느 정도로 관여하는지에 대해 연구된 바는 없음. 본 연구에서는 일란성과 이란성 쌍둥이에서 DNA methylation정도를 측정함으로써 이러한 유전적인 요인이 얼마나 관여하는 지에 대한 결과를 제시할 수 있을 것이며, 이러한 결과로 부터 우수한 논문을 출간할 수 있을 것으로 기대하고 있음.

( 출처: 국문 요약문 4p )

Abstract ▼

□ Purpose&Contents
The importance of hypomethylation in SLE is well recognized; however, the significance of hypermethylation has not been well charcaterizaed. We screened hypertheylated marks in SLE and investigated their possible implications. DNA methylation marks were screened in SLE whole-bl

□ Purpose&Contents
The importance of hypomethylation in SLE is well recognized; however, the significance of hypermethylation has not been well charcaterizaed. We screened hypertheylated marks in SLE and investigated their possible implications. DNA methylation marks were screened in SLE whole-blood DNA by microarray, and two marks (CD3Z and VHL hypermethylations) were confirmed by a methylation single-base extension method in two independent ethnic cohorts consisting of 207 SLE patients and 151 controls.
The correlation with clinical manifestations and the genetic influence on those epigenetic marks were analysed.

□ Results
Epigenetic marks with differential methylation levels in the patients with SLE were screened by microarray using six SLE and six control blood DNA samples. Two epigenetic marks, CD3Z and VHL hypermethylation, were significantly correlated with SLE: CD3Z hypermethylation and VHL hypermethylation, and the increased CD3Z methylation was correlated with downregulation of the CD3 zeta-chain in SLE T cells. The Korean patients with SLE showed significantly higher GI methylation levels for the CD3Z and VHL marks than those observed in controls. Significantly higher methylation for the two the two marks was also observed in the American cohorts. In addition, less genetic influence on CD3Z methylation relative to VHL methylation was found in analyses of longitudinal and twin samples.
Furthermore, a higher CD3Z methylation level was significantly correlated with a higher SLE disease activity index and more severe clinical manifestations, such as proteinuria, haemolytic anaemia and thrombocytopenia, whereas VHL hypermethylation was not.

□ Expected Contribution
CD3Z hypermethylation is an SLE risk factor that can be modified by environmental factors and is associated with more severe SLE clinical manifestations, which are related to deranged T cell function by downregulating the CD3zata-chain. Our results will contribute significantly to the current understanding of the epigenetic factors at play in the pathogenesis of SLE; thus opening avenues for further research into epigenetic pathogenesis in human multifactorial complex diseases.

( 출처: SUMMARY 5p )

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 국문 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 5
• 목차 ... 6
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 7
• 1-1. 연구개발 목적 ... 7
• 1-2. 연구개발의 필요성 ... 10
• 1-3. 연구개발범위 ... 10
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 11
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 14
• 3-1. 선행연구결과 ... 14
• 3-2. 1차년도 연구결과 ... 20
• 3-3. 2차년도 연구결과 ... 29
• 3-4. 3차년도 연구결과 ... 35
• 3-5. 연구개발 추진전략 및 방법 ... 39
• 3-6. 연구개발 추진체계 ... 40
• 3-7. 연구개발 추진일정 ... 41
• 3-8. 연구개발성과 ... 42
• 4. 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 42
• 4-1. 목표달성도 ... 42
• 4-2. 관련분야 기여도 ... 44
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 45
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 45
• 7. 연구개발성과의 보안등급 ... 46
• 8. 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비 현황 ... 46
• 9. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 46
• 10. 연구개발과제의 대표적 연구실적 ... 47
• 11. 기타사항 ... 47
• 12. 참고문헌 ... 48
• [별첨4] 실적 증빙자료 ... 49
• [별첨5] 기타 첨부서류 ... 61
• 끝페이지 ... 68