[보고서]가축 장내미생물 및 유용유전자 활용을 통한 돼지의 생산성 향상 연구 개발

강대경

보고서 정보

주관연구기관

단국대학교
DanKook University

연구책임자

강대경

참여연구자

오주경 , 김상훈 , 바곤베르나데트 , 황인찬 , 오예나 , 윤숙희 , 테레페 , 이원석 , 구현진 , 유지현 , 이찬호 , 강정선 , 조경진 , 이연정 , 오유근 , 슈한 , 양이 , 장왕린 , 하오시저 , 수빈서푼자 , 황수지

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2018-02

과제시작연도

2017

주관부처

농촌진흥청
Rural Development Administration(RDA)

등록번호

TRKO201800043370

과제고유번호

1395049032

사업명

차세대바이오그린21

DB 구축일자

2019-05-18

키워드

돼지.유산균.사료 첨가제.생산성.미생물 유전체.Pig.Probiotics.Feed additive.Productivity.Gut microbiome.

DOI

https://doi.org/10.23000/TRKO201800043370

표 장내세균의 유해균 및 유해물질 억제 기작 (Nature Immunology, 2013)
표 Functional categories of protein-encoding genes of L. mucosae LM1. Genes and proteins detected in the genome (gray) and proteome (black) were identified and grouped according to the cluster of orthologous groups (COG), respectively
표 Highly abundant proteins (>1.0% of the intracellular proteome) in L. mucosae LM1 based on the total mass spectrometry intensity level sorted according to putative COG or KEGG functional categories
표 Overview of the KEGG-annotated metabolic pathways of L. mucosae LM1. The map shows the presence of genes (red) and proteins (green) in the genomic and proteomic data of L. mucosae LM1, respectively. KEGG Orthology (KO) are activated are related to general metabolic pathways (KO01100), carbohydrate metabolism (KO01200), biosynthesis of amino acids (KO01230), secondary metabolites (KO01100) and antibiotic compounds (KO01130)
표 The proposed pathway for energy production, based on the KEGG-associated proteins found in the proteome of L. mucosae LM1. (A) Breakdown of carbohydrate molecules in L. mucosae LM1 is via the phosphoketolase pathway. (B) Putative citrate uptake and fermentation pathways in L. mucosae LM1. Citrate is converted to malate to be used either as a substrate for energy production or to produce short chain fatty acid, succinate
표 Putative pathway and gene operon of glycogen synthesis and degradation in L. mucosae LM1. (A) Glucose is converted to glucose-6-phosphate then glucose-1-phosphate, which acts as the substrate for GlgC and GlgD to form α -D-glucose phosphate. GlgA creates linear α-1,4-glucan through the transfer of glucosyl moieties, which will be cleaved by GlgB to attach glucan chains and create glycogen. Glycogen biosynthesis is indicated by black arrows, whereas glycogen degradation is indicated by dashed grey arrows. (B) The organization of the 10.1 kb gene operon encoding for the synthesis and degradation of glycan in L. mucosae LM1
표 Description of treatment groups
표 Ingredients and chemical composition of the basal diet (as-fed basis)3
표 Mean relative abundance (% of total sequences) of 32 differentially abundant bacterial genera between control (CON) and lactulose (LAC) groups
표 Metagenomic DNA isolation from piglets. A: Control group, B: Lactulose group
표 16S rRNA gene PCR product from metageniomic DNA isolated from piglets
표 Box plot summarizing the pyrosequencing data and microbial diversity among pig groups. Pig groups are depicted as CON = control/basal diet andLAC = basal diet with lactulose. (A) Valid reads and operational taxonomic units (OTU at >97% identity threshold) and (B) abundance-based coverage estimate(ACE) and Shannon diversity estimate are presented. The interquartile range is represented by the outer bounds of the boxes, the median is represented bythe midline (black), and the outliers are represented by the white circles (). The whiskers represent the minimum and maximum values. Kruskal-Wallissignificance tests showed significant differences between CON and LAC groups before and after treatment (PValid reads= 0.001 and POTU= 0.006) and microbialdiversity and richness (PShannon= 0.004 and PACE= 0.01)
표 The mean relative abundances of bacterial phyla in faecal samples before (left) and after (right) lactulose administration. Values represent the meanproportions from total sequence reads for each group: CON = basal diet, LAC = basal diet with lactulose. These groups are depicted as horizontal lines (CON;top) and vertical lines (LAC; bottom) as patterns for each group for different phyla. Kruskal-Wallis non-parametric test was used to calculate for statistical significance (PFirmicutes= 7.529 × 10-6; PBacteroidetes= 9.507 ×10−8)
표 Heat map showing normalized values of 32 differentially abundant genera (>0.1% abundance) between the control (CON) and lactulose (LAC) groups before and after the experiment. Genera with an abundance of >1.0% observed in at least one group are underlined. The normalized abundance values are depicted visually from black to white; black represents the highest abundance, and white the lowest. The dendrogram shows the distances of the pig groups (top) and bacterial genera (right) based on their relative abundances
표 Relative abundances (% of total sequences) of bacterial OTU at >97% identity threshold among control (CON) and lactulose (LAC) groups after the experiment. The percent abundance of the four most abundant Lactobacillus spp. (A) and Clostridium spp. (B) were compared between the control and lactulose groups. The interquartile range is indicated by the outer bounds of the boxes, the median by the midline (black), and the outliers are indicated by the black circles (●). The whiskers represent the minimum and maximum values. P-values were indicated as a test for significance at P < 0.05
표 Canonical loading plot showing the 32 differentially abundant bacterial genera in the discriminant analysis of principal components. The individual peaks show the magnitude of the influence of each variable to separation of the CON and LAC groups before and after the experiment. At the 0.05 threshold level, the majority of the separation among the pig groups before and after lactulose administration was attributed to Prevotella, Subdoligranulum, Clostridium, Parasutterella, Alloprevotella, Dialister,Oscillibacter and Streptococcus
표 Separation of swine microbiota based on lactulose administration. Discriminant analysis of principal components revealed distinct clustering of the control (CON) and lactulose (LAC) groups using OTU at the 95% identity threshold. Individual pig samples for each period are labeled with the following symbols for the control group (□) and lactulose group (○) before (grey) and after (black) the administration of lactulose as a prebiotic
표 Buffer solution of plasmid prep
표 Primer sequences
표 Agarose gel electrophoresis of plasmid DNAs isolated from Lactobacillus sp
표 16S rRNA gene sequences of the isolated strain, LP27
표 Digestion of pLP27 with various restriction enzymes
표 Agarose gel electrophoresis of plasmid pLP27 recovered from LP27 strain
표 Complete nucleotide sequence of pLP27
표 Map of pLP27
표 Plasmid map of pULP1 cloning vector
표 Up-regulated proteins induced by bile in L. johnsonii PF01
표 Plasmid map of pULP2gus
표 Construction of pULP2gus shuttle vector
표 Primer and nucleotide sequence of recombinant LDH1-p from L. johnsonii PF01 strain
표 Agarose gel electrophoresis of plasmid DNAs isolated from Lactobacillus sp
표 GusA activity assay in L. plantarum SK156 harboring pULP2gus
표 Confirmation of LAB transformants by PCR
표 The list of Lactobacillus spp. for pULP2gus transformatioin
표 Primer sequences
표 Transformation efficiency of various Lactobacilli host candidate
표 Transformation efficiency of various Lactobacilli host candidate
표 Transformation efficiency of various Lactobacilli host candidate
표 Membrane glycoprotein structure of korea type PEDV and its epitopes
표 slpA gene sequence from L. acidophilus ATCC 4356. A, signal sequence. B, Cell wall anchor sequence
표 Main features of the fusion of the surface layer A (slpA) protein from L. acidophilus ATCC 4356 and PEDV antigen gene
표 Construction of pULP3 cell surface display system
표 Fluorescence microscopy of immunofluorescence activity showing the surface localization of the PEDV epitopes gene using slpA protein
표 Functional categories of protein-encoding genes in the IPEC-J2 cell line. Proteins were categorized into molecular function(A) according and biological processes(B) to the GO database. The number of proteins is labelled beside each bar
표 Highly abundant proteins (>1.0% in relative abundance, n=20) and less abundant protein (0% < x < 1.0% in relative abundance) were detected in the intracellular proteome of IPEC-J2
표 Proposed pathway for the regulation of mucosal immunity, epithelial barrier function, and structural integrity. The network of IPEC-J2 proteins annotated was based on KEGG (http://www.kegg.jp/). The map shows the presence of proteins involved in receiving external stimuli, signal transduction, and regulation of cellular functions in IPEC-J2 cells. Proteins are abbreviated accordingly (F3, tissue factor F3; Src, tyrosine kinase; RhoA, Ras homolog A; ZO-1, tight junction protein 1/zonula occludens; MAPK, mitogen-activated protein kinases; Rac1, rho family, small GTP binding protein Rac1;NFkB, nuclear factor kappa B complex; ApoD, apolipoprotein)
표 Volcano plot The red lines represent the up (red square) and down (green square) regulated expressed proteins (p < 0.05)
표 KEGG pathways of folate biosynthesis. The map shows the presence of genome data (black) and the expressed proteomic data of folate pathway(red;up-regulated/blue;down-regulated)
표 Down regulated of exopolysaccharides biosynthesis gene cluster
표 Up-regulated proteins in IPEC-J2 cells during co-incubation with L. mucosae LM1
표 Composition of the basal diet (as-fed basis)
표 Description of treatment groups
표 Summary of the 16S rRNA gene pyrosequencing reads from each pig sample after the administration of prebiotic lactulose (LAC), probiotic E. faecium NCIMB 11181 (PRO) and synbiotic mixture (SYN)
표 Metagenomic DNA isolation from piglets. con, control group; lac, prebiotc(lactulose) group; pro, probiotic group; syn, synbiotic group
표 16S rRNA gene PCR product from metageniomic DNA isolated from piglets
표 Summary of sequence reads after quality control and microbial diversity of each group of pigs
표 Rarefaction curves of pooled pig samples with an OTU definition at 97% identity level created by using CD-HIT in Mothur. Coloured lines depict each control(CON), prebiotic lactulose (LAC), probiotic Enterococcus faecium NCIMB 11181 (PRO), synbiotic (SYN) groups
표 a-Diversity measurements of pig faecal microbiota according to treatment. Microbial richness estimates(Chao1 and ACE) and diversity indices (Shannon and Simpson) provide measures of diversity within each community at an OTU identity cut-off of 97%. Each group is labelled accordingly: CON, control; LAC, prebiotic lactulose; PRO, probiotic Enterococcus faecium NCIMB 11181; SYN, synbiotic. The Kruskal-Wallis non-parametric test for significance was performed to assess differences among pig groups; PChao1 = 0.001, PACE = 0.001, PShannon = 0.002, PSimpson = 0.03
표 Doughnut plots of the relative abundances of sequences at the phylum and family levels. The EzTaxon database was used to classify the taxon groups. Mean relative abundances were calculated from all samples in each group; outer and inner plots depict selected taxa at the phylum and family levels respectively
표 Mean values of the relative abundances (% of total sequences) of selected bacterial phyla and families between CON, LAC, PRO, SYN groups
표 Differentially abundant bacterial genera among the CON, LAC, PRO and SYN groups. Piglets in the control group received a basal diet during the entire experimental period, whereas piglets receiving treatments were fed the basal diet plus the assigned feed additive. A. The heatmap shows the 33 abundant genera (> 0.1% mean relative abundance) after normalization. The normalized levels of abundance are depicted in the colour key, where white represents the lowest (min=0) and black (max=7) shows the highest level of abundance. Columns represent treatment groups, and rows indicate the bacterial genera. B. The canonical loading plot shows peaks for the bacterial genera that had strong influences on the differentiation of the control from the treatment groups. C. Clustering of the faecal microbiota according to treatment was performed by DAPC plot using the 33 differentially abundant bacterial genera as variables
표 OTU-based community structures and compositions in the faecal microbiota after treatment. A. Venn diagram showing the distribution of OTUs for the CON, LAC, PRO and SYN groups. Numbers indicate the number of OTUs that were unique and the number shared (core) by two or more groups, as depicted by non-intersecting and intersecting ellipses respectively. B. The canonical loading plot shows the peaks of all bacterial OTUs that had strong influences on the separation of the control and treatment groups. C. Clustering of the faecal microbiota according to treatment was performed by DAPC plot using all bacterial OTUs at a 95% identity cut-off as variables
표 Boxplot of the normalized abundance of discriminating bacterial genera and OTU according to linear discriminant analysis (loadingplot)
표 TNF-ɑ, IL-10 and IFN-γ responses in IPEC-J2 cells infected with stimulated with PEDV atigens. Concentrations of TNF-ɑ, IL-10 and IFN-γ in the cell supernatants were detected by ELISA. Error bars indicate the standard error of the mean. ‘*’ indicate the results of significance testing for the epitope groups versus no treatment group (ANOVA test, p < 0.05)
표 Antibody levels of 6 groups on days 0, 21, 35 post first immunization. IgG in sera and IgA in feces prepared from mice orogastrically administered with surface displayed M1, M2, M3, Whole M (WM), S1 PEDV epitopes and wild type L. plantarum SK156, respectively. Values are means (standard deviation) of 3 replicates per treatment in 1 experiment. ‘*’indicate the results of significance testing for the epitope groups versus wild type L. plantarum SK156 (ANOVA test, p < 0.05)
표 Cytokine responses of sera from mice immunized with surface displayed M1, M2, M3, Whole M (WM), S1 PEDV epitopes and wild type L. plantarum SK156, respectively. And then detection of interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6) and interferon gamma (IL-10)
표 Metagenomic DNA isolation from pig
표 Diversity indices of the gut microbiota from pig using 16S rRNA sequences
표 Rarefaction curves of each pig samples with an OTU definition at 97% identity level created by PD_whole_tree
표 α-diversity measurements of pig fecal microbiota according to group. Microbial richness estimates(ACE and Chao1) and diversity indices (Shannon and Simpson) provide measures of diversity within each community at an OTU identity cut-off of 97%
표 Relative abundance of sequences at the phylum(A) and family(B) level. The Greengenes database was used to classify the taxon groups. Mean relative abundance of all samples were calculated for each group
표 Principal component analysis of pig fecal bacterial community (A). Principal component analysis of pig bacterial community was based on comparisons of 16S rRNA gene.(B) Box plot representing the differences between Low-weight group and High-weight group for body weight and ADG. HW, High-weight; LW, Low-weight
표 Relative abundance of sequences at the genus level. The Greengenes database was used to classify the taxon groups. Box plot representing the differences between Low-weight group and High-weight group at the genus level using T-test (P < 0.05)
표 Correlation between the relative abundance of genera and the growth performance of pig. Pearson correlation coefficients are represented by colour ranging from blue, negative correlation (−1), to red, positive correlation (1). ADG, Average daily gain;BW, Body weight; P, P-value; R, R-value
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP2 균주 유전체 지도 및 진화적으로 가속화된 호스트 면역 증진 유용유전자 7종
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP2 균주의 오픈리딩프레임의 기능 카테고리 (a) 시드 데이터베이스 (SEED database) 기준, (b) 코그 데이터베이스 (COG database) 기준
표 비교 트리 분석
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP2 유산균 균주 유래 브랜치 모델 (branch model)로 검증한 진화적으로 가속화된 유용유전자의 기능
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP2 유산균 균주 유래 브랜치-사이트 모델 (branch-site model)로 검증한 진화적으로 가속화된 유용유전자의 기능 및 아미노산 변이 위치
표 락토바실러스 퍼멘텀 SK152의 항균활성을 보여주는 한천확산 분석
표 락토바실러스 퍼멘텀 SK152의 유전체 상에서 발견된 항균활성관련 유전자
표 미생물 균주의 항균성 관련 유전자 상에 위치한 단백질 도메인 분석
표 락토바실러스 퍼멘텀 SK152의 브랜치 (branch) 및 브렌치-사이트 모델 (branch-site model)로 검증한 진화적으로 가속화된 유용유전자의 기능 및 아미노산 변이 위치
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP1 균주 유전체 지도 및 진화적으로 가속화된 유용유전자 와크리스퍼(CRISPR)로 예측되는 지역
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP1 균주의 오픈리딩프레임의 기능 카테고리 (a) 시드 데이터베이스 (SEED database) 기준, (b) 코그 데이터베이스 (COG database) 기준
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP1의 유전자 섬 (genomic islands) 분석
표 락토바실러스 플란타룸 균주들의 비교 계통 분석
표 가장 가까운 종들과 락토바실러스 플란타룸 GB-LP1의 염기서열 분석
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP1 유산균 균주 유래 브랜치-사이트 모델 (branch-site model)로 검증한 진화적으로 가속화된 유용유전자의 기능 및 아미노산 변이 위치
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP1 균주의 유전체 지도
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP3의 기능 유전자 예측 (a) 시드 데이터베이스 기준, (b) 코그 데이터베이스 기준
표 계통수 비교 분석
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP3 특이적 유전자 후보군
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP3 균주 유래 브랜치-사이트 모델 (Branch-site model)로 검증한 진화적으로 가속화된 유용유전자
표 진화분석에 이용된 15개의 유전자의 유전자 변이 비교
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP2 유산균 균주 유래 브랜치 모델 (branch model)로 검증한 진화적으로 가속화된 유용유전자의 기능
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP2 유산균 균주 유래 브랜치-사이트 모델 (branch-site model)로 검증한 진화적으로 가속화된 유용유전자의 기능 및 아미노산 변이 위치
표 락토바실러스 플란타룸 GB-804 유산균 균주 유래 브랜치 및 브랜치-사이트 모델 (branch-site model)로 검증한 진화적으로 가속화된 유용유전자의 기능 및 아미노산 변이 위치
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP1이 가지고 있는 유용 유전자 중 사료첨가제에 이용시 유익할 것으로 예상되는 유전자 리스트
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP2가 가지고 있는 유용 유전자 중 사료첨가제에 이용시 유익할 것으로 예상되는 유전자 리스트
표 사료첨가제에 이용할 것으로 제시한 균주 조합 및 예상 기능
표 락토바실러스 플란타룸에 대한 웹 기반 데이터베이스
표 데이터베이스에서 제공하는 시각화된 유전체 정보
표 데이터베이스에서 제공하는 유전체 비교 도구
표 대장균 및 살모넬라균주에 대한 항균활성 보유균주 선발
표 발효방식에 따른 선발균주 발효 특성 (A-액체발효, B-고체발효)
표 선발균주의 발효방식에 따른 발효물의 pH 안정성 비교평가 (A) 선발균주 고체발효물, (B) 선발균주 액체발효물
표 선발균주의 발효방식에 따른 내열성 비교평가 결과
표 발효방식에 따른 lactic acid 생성능 비교
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP1 균주 유전자 정보
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP2 균주 유전자 정보
표 락토바실러스 플란타룸 GB-LP3 균주 유전자 정보
표 선발균주의 유해균주 별 항균활성 평가결과
표 선발균주의 최적 액상발효 배지 선정을 위한 후보 배지조성
표 선발균주의 액체발효 배지조성에 따른 균수 변화
표 L. plantarum GB-LP2 균주의 최적 배지에서의 시간별 균수 및 pH 변화
표 선발균주의 최적 고체발효 배지 선정을 위한 후보 배지조성
표 선발균주의 고체발효 배지조성에 따른 균수 변화
표 L. plantarum GB-LP2 균주의 최적 배지에서의 시간별 균수 및 pH 변화
표 선발 균주 (L. plantarum GB-LP2)의 배양온도 및 가수량에 따른 고체발효 결과
표 원료두께에 따른 발효특성 조사 (a: 10cm, b: 20cm, c: 30cm, d: 40cm)
표 최적 발효조건에서의 발효방식에 따른 균수 및 pH 변화
표 발효시간별 균수 변화 (단독발효)
표 발효시간별 균수 변화 (복합발효)
표 단독 및 복합 발효물의 항균활성 평가
표 단독 및 복합발효 균주의 pH 안정성 조사
표 단독 및 복합발효 균주의 열안정성 조사
표 LC/MS/MS의 분석조건
표 Lactic acid 및 phenyllactic acid 표준품을 이용한 검량선
표 발효조건에 따른 선발균주의 유기산 생성량 비교
표 복합 발효물의 PLA 함량 변화
표 육성돈 사료 내 가축 장내 미생물 유용유전자 첨가가 육성돈의 생산성에 미치는 영향
표 육성돈 사료 내 가축 장내 미생물 유용유전자 신소재 첨가가 육성돈의 영양소 소화율에 미치는 영향
표 육성돈 사료 내 가축 장내 미생물 유용유전자 신소재 첨가가 육성돈의 분내 미생물에 미치는 영향
표 이유자돈 사료 내 개발제품 첨가가 생산성에 미치는 영향
표 액상발효를 통한 종균 생산결과 (발효 24시간)
표 혼합 종균 첨가수준별 발효실험 결과 (A: L. plantarum GB-LP2 + L. plantarum GB-804, B: L. plantarum GB-804 + L. plantarum GB-805, C: L. plantarum GB-804 + L. plantarum GB-805)
표 Pilot scale 조건에서의 발효시간에 따른 균수 변화
표 최적 pilot scale 발효공정에서의 유용유전자 조합 미생물의 생산 결과
표 개발제품의 유기산 함량 분석결과
표 개발제품 및 시판제품의 내열성 평가결과 (A: 개발제품, B: 시판제품)
표 펠렛 가공조건에서의 내열성 평가 결과 (L. plantarum GB-LP2 + L. plantarum GB-805)
표 개발제품의 pH 안정성 평가 결과
표 개발제품 및 시판제품의 대장균 및 살모넬라 균주에 대한 항균활성 평가 결과
표 개발제품의 실온조건에서의 저장안정성 평가 결과 (6개월)
표 육성돈 사료 내 개발제품 첨가를 통한 생산성 개선효과
표 개발제품의 급여가 혈액성상에 미치는 영향 (mg/dL)
표 개발제품 급여가 분내 미생물 균총 변화에 미치는 영향 (Lactobacillus spp., Log CFU/g)
표 비육돈 사료 내 개발제품 첨가를 통한 생산성 개선효과
표 비육돈 사료 내 개발제품 첨가가 혈액 특성에 미치는 영향
표 개발제품 급여가 분내 미생물 균총 변화에 미치는 영향 (Lactobacillus spp., Log CFU/g)
표 연구개발물의 활용방안

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가축 장내미생물 및 유용유전자 활용을 통한 돼지의 생산성 향상 연구 개발
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