초록 ▼

6. 연구결과
가. 문화재청으로부터 천연기념물 제454호 미호종개의 포획 및 훼손 현상변경이 승인되었고, 미호종개 30개체 및 점줄종개 확보됨.
나. 침투성 동해방지제 종류 결정 실험을 통해 DMSO 및 EG가 함유된 동결액이 비교적 높은 세포생존율을 나타냈으며, 농도 실험을 통해 1.3 M DMSO에서 가장 높은 해동 후 세포 생존율이 측정됨.
다. 앞선 실험을 통해 얻은 1.3 M DMSO에 비침투성 동해방지제 실험을 진행한 결과, FBS 첨가군과 trehalose첨가군이 해동 후 세포 생존율이 유의적으로 높았으

6. 연구결과
가. 문화재청으로부터 천연기념물 제454호 미호종개의 포획 및 훼손 현상변경이 승인되었고, 미호종개 30개체 및 점줄종개 확보됨.
나. 침투성 동해방지제 종류 결정 실험을 통해 DMSO 및 EG가 함유된 동결액이 비교적 높은 세포생존율을 나타냈으며, 농도 실험을 통해 1.3 M DMSO에서 가장 높은 해동 후 세포 생존율이 측정됨.
다. 앞선 실험을 통해 얻은 1.3 M DMSO에 비침투성 동해방지제 실험을 진행한 결과, FBS 첨가군과 trehalose첨가군이 해동 후 세포 생존율이 유의적으로 높았으며, 농도 결정 실험을 통해 최종적으로 6% FBS, 0.3 M trehalose 결정됨.
라. 냉각속도 최적화 실험은 –0.5, -1, -5, -10℃/min의 냉각속도 중 75.46±2.44%의 해동 후 세포 생존율을 나타낸 –1℃/min 의 냉각속도가 적합함.
마. 해동온도 최적화 실험은 21℃, 26℃, 31℃, 36℃의 온도에서 각각 해동하였고, 72.02±4.21%의 세포 생존율을 나타낸 26℃에서 해동된 실험구가 31℃ 및 36℃에서 해동된 실험구들에 비해 유의적으로 높은 세포 생존율을 나타내었고, 21℃에서 해동된 실험구와는 유의적인 차이를 나타내지 않았음.
바. 실험을 통해 확인된 최적 동결 조건을 미호종개에 적용하였고, 비교를 위해 1.3 M DMSO만 첨가된 동결액과 세포 생존율을 비교한 결과, 최적 동결조건이 1.3 M DMSO만 첨가된 동결액보다 유의적으로 높은 세포 생존율을 나타내었음.
바. 대리모는 근연종을 대상으로 실험적, 사육환경적 및 형태적 차이 등을 고려하여 유전적 분석 없이 표현형만으로 대리모와 미호종개를 구분할 수 있는 알비노 미꾸리(Misgurnus anguillicaudatus)와 점줄종개(Cobitis lutheri)로 후보를 선정하였음.
사. 인공증식 및 사육관리 매뉴얼을 작성하여, 대리모의 대량증식기술을 확립하였으며, 난발생 및 초기생활사를 규명하였음.
아. 대리모의 3배체 불임화 기술을 확립하기 위해 예비실험을 진행하였으며, 예비실험을 통해 수정 후 3분, 9,000 PSI, 1분, 1분 30초, 9,500 PSI, 1분, 1분 30초의 조건이 적절한 것으로 확인되었음.
자. 자어 미세현미주입 조건의 예비탐색을 통해 자어 holding platform의 한천배지 농도는 0.7%내외의 agarose 농도가 적절하였고, 자어 마취조건은 부화 2일 까지는 100 ppm의 MS-222, 3일 이후부터는 200 ppm의 MS-222가 적절하였다. 마취 회복시간은 2-3분 정도가 필요하였으며, 99% 이상의 생존율을 보였음. 주입용 needle의 조건은 자어의 발달단계에 따라 차등으로 나타났지만, 2일-3일 째 자어와, 적절한 바늘 끝모양을 가진 20~25㎚, 30~35㎚의 needle이 적합하였음. 또한 두 차례의 생존율 평가를 통해 needle 직경 조건과 자어 발달 단계는 생존율에 유의적인 영향을 미치지는 않는 것으로 판단되었음.
자. 대리모인 알비노 미꾸리 자어를 이용해 정소세포 주입 및 예비평가를 실시한 결과, 3일째 까지 일부 자어들의 폐사가 관찰되었으나, 4일째 이후 안정화되기 시작하여 유의적인 폐사 경향을 보이지 않았음. 4일째 누적 생존율은 93.2%로 나타남.

(출처 : 요약문 6p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 요약문 ... 4
• 목차 ... 8
• 1. 연구목적 및 배경 ... 10
• 2. 연구수행 방법 ... 12
• 가. 멸종위기 어류 미호종개 (Cobitis choii) 확보 ... 12
• (1) 천연기념물 미호종개 포획 및 훼손을 위한 현상변경허가 취득 ... 12
• (2) 실험어 채집 ... 12
• 나. 생식줄기세포의 장기동결보존법 확립 ... 13
• (1) 생식줄기세포의 초저온동결보존법 확립 ... 13
• (2) 초저온동결보존 후 세포 생존율 조사 ... 14
• 다. 미호종개(Cobitis choii) 생식줄기세포의 이종간 이식 조건 검토 ... 15
• (1) 미호종개(C. choii) 생식줄기세포를 이식하기 위한 대리모 선정 ... 15
• (2) 대리모의 대량증식기술 확립 ... 15
• (3) 대리모의 3배체 불임화 기술확립 ... 15
• (4) 미꾸리과 어류 자어 미세현미주입 조건의 예비탐색 ... 18
• 3. 연구수행 결과 ... 21
• 가. 멸종위기 어류 미호종개 확보 ... 21
• (1) 천연기념물 미호종개 현상변경허가 ... 21
• (2) 실험어 채집 ... 22
• 나. 생식줄기세포의 장기동결보존법 확립 ... 23
• (1) 침투성 동해방지제의 종류 및 농도 최적화 ... 23
• (2) 비침투성 동해방지제의 종류 및 농도 최적화 ... 25
• (3) 냉각속도 최적화 ... 28
• (4) 해동온도 최적화 ... 28
• (5) 최적 동결 조건의 미호종개 적용 ... 29
• 다. 미호종개 생식줄기세포의 이종간 이식 조건 검토 ... 31
• (1) 미호종개 생식줄기세포를 이식하기 위한 대리모 선정 ... 31
• (2) 대리모의 대량증식기술 확립 ... 32
• (3) 대리모의 3배체 불임화 기술 확립 ... 47
• (4) 미꾸리과 어류 자어 미세현미주입 조건의 예비탐색 ... 52
• 4. 결론 및 요약 ... 61
• 끝페이지 ... 61