[보고서]근골격 줄기세포를 이용한 근골격계 질환치료기술개발

한명관

보고서 정보

주관연구기관

전북대학교
Chonbuk National University

연구책임자

한명관

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2019-02

과제시작연도

2018

주관부처

과학기술정보통신부
Ministry of Science and ICT

등록번호

TRKO201900021812

과제고유번호

1711071496

사업명

바이오.의료기술개발(R&D)

DB 구축일자

2020-05-23

키워드

근골격줄기세포.배아줄기세포.연골.뼈.인대.Musculoskeletal stem cells.embryonic stem cells.cartilage.bone.tendon.

표 “근골격 줄기세포를 이용한 근골격계 질환치료기술개발” 과제의 연구개요도
표 인간 배아줄기세포로부터 분화된 새로운 인간 근골격줄기세포의 세포형태. 인간 배아줄기세포 (H9)를 LIF와 FGF2존재하에서 Wnt signaling pathway를 GSK3β inhibitor로 활성화시키고 TGF-β/activin/nodal 및 ERK signal pathway를 각각의 억제제로 억제시키면서 single cell passaing에 의해 7계대에서 19계대 까지 계대 배양함. blue arrow는 β-galactosidase positive cell을 나타냄
표 인간 배아줄기세포와 이로부터 유도한 새로운 인간 근골격 줄기세포의 pluripotent marker 발현. 인간 배아줄기세포와 이로부터 유도한 새로운 인간 근골격 줄기세포를 Oct4, Nanog, Sox2 및 Lin28에 특이항체로 염색한 후 형광현미경으로 이미지를 얻음. DAPI는 핵을 대조염색한 것임
표 새로운 근골격줄기세포의 여러 계통의 특이 마커 분석. 새로운 인간 근골격 줄기세포를 α-SMA, Pax6, Pax7, LGR5, SOX9 및 MyoD 에 특이항체로 염색한 후 형광현미경으로 이미지를 얻음. DAPI는 핵을 대조염색한 것임
표 새로운 근골격 줄기세포의 혈액계통 및 중간엽 줄기세포 세포 표면 항원의 발현. H9 hESC로부터 유도된 새로운 근골격 줄기세포를 10계대 동안 계대배양한 세포를 혈액계통 및 중간엽 줄기세포 세포 표면 항원에 대한 항체로 염색한 유식세포분석기로 분석함
표 인간 중간엽 줄기세포 및 새로운 인간 근골격 줄기세포의 실험관내 골, 연골, 지방 분화능을 비교. 인간 중간엽 줄기세포 및 새로운 인간 근골격 줄기세포를 골형성분화배지(StemPro® Osteogenesis Differentiation Kit, Life technology, USA), 연골형성배지(StemPro® chondrogenesis Differentiation Kit, Life technology, USA), 지방 형성 분화 배지(StemPro®adipogenesis Differentiation Kit, Life technology, USA)로 분화하였음
표 새로운 인간 근골격 줄기세포의 골격근으로의 분화능. 새로운 인간 근골격 줄기세포를 matrigel로 coating된 coverslips 위에서 골격근분화배지(2% B27이 함유된 DMEM)로 2주 동안 배양하여 분화함. C2C12는 골격근 마커 MYH의 양성대조로 사용하였음. 세포 면역형광염색을 실시하여 분화여부를 확인하였음. DAPI는 핵을 대조염색한 것임
표 배아줄기세포로부터 유도한 새로운 인간 근골격 줄기세포의 신경세포로의 분화능. 배아줄기세포로부터 유도한 새로운 근골격 줄기세포를 신경 분화 배지(2% B27, 2 mM GlutaMAX 및 항생제를 포함하는 Neurobasal medium)에서 7일 동안 incubation시키고 그 후 0.5 mM 디부틸 cAMP(Sigma)를 3일 동안 매일 첨가하면서 배양하였음. 그 뒤, 신경 세포로의 분화 마커인 MAP2에 대하여 세포면역형광법을 수행하였음. NSC(StemPro®Neural Stem Cells)를 신경세포 분화의 양성 대조군으로 사용하였음. DAPI는 핵을 대조염색한 것임
표 새로운 인간 근골격 줄기세포의 생체내 분화능. 새로운 인간 근골격줄기세포를 agarose well내에서 20% FBS + DMEM에서 48시간동안 배양하여 얻은 세포덩어리를 신장내에 이식하고 4 주후에 꺼내 H&E 염색 (a) 및 근육, 지방, 연골에 대한 각각의 특히항체 anti-pMLC, anti-PPARgamma, anti-scx로 염색 하였음 (b). DAPI는 핵을 대조염색한 것임. 새로운 근골격 줄기세포로부터 유래된 것임을 밝히기 위해 anti-huamn leukocyte antigen (hLA)로 이중 염색을 실시함
표 새로운 인간 근골격 줄기세포의 생체내 분화능. 새로운 인간 근골격줄기세포를 agarose well내에서 20% FBS + DMEM에서 48시간동안 배양하여 얻은 세포덩어리를 신장내에 이식하고 4 주후에 꺼내 microCT (a), H&E 염색 (b), pentachrome염색 (c) 및 골에 대한 특히항체 anti-Osx, anti-Runx2, anti-DMP1, anti-Sclerostin, anti-OCN 및 혈관 특이 항체 anti-vWF 로 염색 하였음 (d). DAPI는 핵을 대조염색한 것임. 새로운 근골격 줄기세포로부터 유래된 것임을 밝히기 위해 anti-huamn leukocyte antigen (hLA)로 이중 염색을 실시함
표 인간 중간엽 줄기세포의 대퇴골 골절 회복에 대한 효과. 대퇴골 골절 모델에서 인간 중간엽 줄기세포의 골형성을 분석하기 위해서, 인간 중간엽 줄기세포(Lonza, Switzerland)를 MSCGM-CD(Lonza, Switzerland) 배지로 7 계대 배양하여 단일세포로 수집한 후 l mm x l mm로 절단한 콜라겐 멤브레인(SK bioland, Korea)에 세포를 흡수시킴. 6주령의 Balb/c- 누드마우스에서 한쪽의 경골을 1 mm 정도 드릴(Bosch professional, Germany)로 구멍을 낸 후 콜라겐 멤브레인이 함유하고 있는 인간 중간엽 줄기세포를 마우스의 골절부위에 삽입함. 매 2 주마다 마우스를 마취한 후 골절부위에 대해 Micro-CT(Skyscan 1076, Antwerp, Belgium)를 사용해서 이미지를 얻음 (a). 6주 후에 H&E 염색 (b, c)과 골 마커인 Runx2에 대한 항체 anti-Runx2, 인간 중간엽 줄기세포 유래임을 보이기 위한 anti-huamn leukocyte antigen (hLA)로 이중 염색을 실시함 (d). DAPI는 핵을 대조염색한 것임
표 새로운 인간 근골격 줄기세포의 대퇴골 골절 회복에 대한 효과. 대퇴골 골절 모델에서 새로운 인간 근골격 줄기세포의 골형성을 분석하기 위해서, 새로운 인간 근골격 줄기세포를 MSCGM-CD(Lonza, Switzerland) 배지로 3 계대 배양하여 단일세포로 수집한 후 l mm x l mm로 절단한 콜라겐 멤브레인(SK bioland, Korea)에 세포를 흡수시킴. 6주령의 Balb/c- 누드마우스에서 한쪽의 경골을 1 mm 정도 드릴(Bosch professional, Germany)로 구멍을 낸 후 콜라겐 멤브레인이 함유하고 있는 새로운 인간 근골격 줄기세포를 마우스의 골절부위에 삽입함. 매 2 주마다 마우스를 마취한 후 골절부위에 대해 Micro-CT(Skyscan 1076, Antwerp, Belgium)를 사용해서 이미지를 얻음 (a). 6주 후에 H&E 염색 (b, c)과 골 마커인 Runx2에 대한 항체 anti-Runx2, 새로운 인간 근골격 줄기세포 유래임을 보이기 위한 anti-huamn leukocyte antigen (hLA)로 이중 염색을 실시함 (d). DAPI는 핵을 대조염색한 것임
표 새로운 인간 근골격 줄기세포의 대퇴골 골절형 부위 von kossa 염색. 새로운 인간 근골격 줄기세포를 MSCGM-CD(Lonza, Switzerland) 배지로 3 계대 배양하여 단일세포로 수집한 후 l mm x l mm로 절단한 콜라겐 멤브레인(SK bioland, Korea)에 세포를 흡수시킴 (붉은색 사각형 부분이 골절 부위임). 6주령의 Balb/c- 누드마우스에서 한쪽의 경골을 1 mm 정도 드릴(Bosch professional, Germany)로 구멍을 낸 후 콜라겐 멤브레인이 함유하고 있는 새로운 인간 근골격 줄기세포를 마우스의 골절부위에 삽입함. 6주 후에 Von kossa 염색을 실시함
표 유도만능줄기세포의 유도 및 특성. OCT4, KLF4, SOX2, 및 MYC를 발현하는 sendai virus를 IMR90 태아 섬유아세포에 감염시켜 리프로그래밍하여 유도만능 줄기세포를 제조함. DAPI는 핵을 대조염색한 것임. (A) 유도만능 줄기세포의 OCT4, Nanog, SSEA3, TRA 1-81에 대한 면역염색. (B) 정상 karyotype를 보이는 유도만능줄기세포의 G-banding. (C) 유도만능줄기세포의 실험관내 분화능. 유도만능줄기세포를 embryoid body로 분화시킨 후 three germ layer 세포로 계속 분화시킴. 세포를 ectoderm marker 인 TUJ1과 nestin, mesoderm marker 인 α-SMA과 desmin, endoderm marker인 SOX17과 FOXA2에 대한 항체 염색염색함. DAPI는 핵을 대조염색한 것임. (D) 유도만능 줄기세포의 생체내 분화능. 유도만능줄기세포를 matrigel에 썩어 피하에 이식한 후 6주후에 형성된 tetratoma를 section 하여 H&E 염색을 실시함. three germ layer 세포로 분화된 조직이 관찰됨. DAPI는 핵을 대조염색한 것임
표 배아줄기세포와 유도만능줄기세포로부터 유도한 새로운 인간 근골격 줄기세포의 pluripotent marker 발현. 인간 배아줄기세포와 유도만능줄기세포로부터 유도한 새로운 인간 근골격 줄기세포를 Oct4, Nanog, Sox2 및 Lin28에 특이항체로 염색한 후 형광현미경으로 이미지를 얻음. DAPI는 핵을 대조염색한 것임
표 유도만능줄기세포로부터 유도한 새로운 근골격 줄기세포의 혈액계통 및 중간엽 줄기세포 세포 표면 항원의 발현. 유도만능줄기세포로부터 유도된 새로운 근골격 줄기세포를 10계대 동안 계대배양한 세포를 혈액계통 및 중간엽 줄기세포 세포 표면 항원에 대한 항체로 염색한 유식세포분석기로 분석함
표 유도만능줄기세포로부터 유도한 새로운 인간 근골격 줄기세포의 실험관내 골, 연골, 지방 분화능. 유도만능줄기세포로부터 유도한 새로운 인간 근골격 줄기세포를 골형성분화배지(StemPro® Osteogenesis Differentiation Kit, Life technology, USA), 연골형성 배지(StemPro® chondrogenesis Differentiation Kit, Life technology, USA), 지방 형성 분화 배지(StemPro®adipogenesis Differentiation Kit, Life technology, USA)로 분화하였음
표 유도만능줄기세포로부터 유도한 새로운 인간 근골격 줄기세포의 골격근으로의 분화능. 유도만능줄기세포로부터 유도한 새로운 인간 근골격 줄기세포를 matrigel로 coating된 coverslips 위에서 골격근분화배지(2% B27이 함유된 DMEM)로 2주 동안 배양하여 분화함. C2C12는 골격근 마커 MYH의 양성대조로 사용하였음. 세포면역형광염색을 실시하여 분화여부를 확인하였음. DAPI는 핵을 대조염색한 것임
표 RNA-seq을 이용한 근골격 줄기세포의 genome-wide transcriptional profiling. 인간 배아줄기세포, 중간엽줄기세포 및 새로운 근골격 줄기세포의 global gene expression의 Hierarchical cluster analysis (A), scatter plot analysis (B) and principal component analysis (C)
표 pluripotency, endoderm, ectoderm, mesoderm, chondrogenesis, osteogenesis 및 adipogenesis와 연관된 주요 유전자의 발현 heat map
표 Heparin첨가에 의한 새로운 인간 근골격 줄기세포의 근육으로의 선별 분화. 배아줄기세포로부터 유도한 인간배아줄기세포를 heparin이 첨가된 matrigel에 섞어 Balb/c nude 마우스에 피하에 이식한 후 4 주 후에 꺼내 H&E staining 및 muscle marker인 p-MLC 와 인간세포 marker인 hLA에 대해 면역 염색을 실시함. DAPI는 핵을 대조염색한 것임
표 CTGF 및 ascorbic acid의 처리에 의한 새로운 인간 근골격 줄기세포의 인대로의 선별 분화. 배아줄기세포로부터 유도한 인간배아줄기세포를 CTGF 및 ascorbic acid로 처리하여 2일간 배양한 후 matrigel에 섞어 Balb/c nude 마우스에 피하에 이식한 후 4주 후에 꺼내 H&E staining 및 tendon marker인 scx 와 인간세포 marker인 hLA에 대해 면역 염색을 실시함. DAPI는 핵을 대조염색한 것임
표 Hyaluronic acid첨가에 의한 새로운 인간 근골격 줄기세포의 연골로의 선별 분화. 배아줄기세포로부터 유도한 인간배아줄기세포를 hyaluronic acid가 첨가된 matrigel에 섞어 Balb/c nude 마우스에 피하에 이식한 후 4 주 후에 꺼내 pentachrome 염색 및 muscle marker인 col2 와 인간세포 marker인 hLA에 대해 면역 염색을 실시함. DAPI는 핵을 대조염색한 것임

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