[보고서]IL-32γ 형질전환 마우스를 이용한 IL-32의 생리학적인 역할 규명

김수현

IL-32γ 형질전환 마우스를 이용한 IL-32의 생리학적인 역할 규명
Characterizing the physiological role of Interleukin (IL)-32 using IL-32γ transgenic (Tg) mice 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	건국대학교 KonKuk University
연구책임자	김수현
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2018-05
과제시작연도	2017
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
등록번호	TRKO201900022994
과제고유번호	1711051844
사업명	개인기초연구(미래부)
DB 구축일자	2020-08-01
키워드	사이토카인.인터루킨-32.형질전환 마우스.LPS 패혈증 모델.ConA 간염 모델.염증 반응.

초록 ▼

□ 연구개요
IL-32γ 형질전환 마우스를 이용한 인터루킨-32의 생리학적 역할 규명: 인터루킨-32는 인터루킨-1β, 인터루틴-6, TNFα와 같은 염증성 사이토카인들과 화학 주성 인자들을 유도하는 전형적인 전염증성 사이토카인으로 알려짐. 이들은 다양한 만성 염증성 질병에서 과 발현하는 것으로 확인되었으며 면역 세포 분화와의 관련성이 알려짐. 그러나 아직 마우스 유전자가 밝혀지지 않아 생체 내에서의 기능과 질병 모델을 통한 기능 연구가 부족함. 따라서 본 과제는 사람의 인터루킨-32 유전자를 도입한 형질전환 마우스를 통한 인터루킨-32의 생리학적 기능을 연구함.

□ 연구 목표대비 연구결과
1차년도(2015)
1. 부분적 간 절재 모델을 이용한 IL-32γ 형질 전환 마우스에서 나타나는 지연된 간 재생 효과 연구
2차년도(2016)
1. IL-32γ를 도입한 형질전환 마우스에 Salmonella Lipopolysaccharides (LPS)를 투여한 후에 마우스 혈청과 조직 내 cytokine profile 조사
- LPS를 이용한 패혈증 모델에서 IL-32γ 형질전환 마우스 분석
2. IL-32γ를 도입한 형질전환 마우스에 Concanavalin A(ConA)를 투여한 후에 마우스 혈청과 조직 내 cytokine profile 조사
- ConA를 이용한 간염 모델에서 IL-32γ 형질전환 마우스 분석
3차년도(2017)
1. IL-32γ를 도입한 형질전환 마우스에서 Vesicular stomatitis virus 투여한 후에 비장 조직 내 인터페론 및 항바이러스 관련 인자 분석

□ 연구개발결과의 중요성
IL-32는 2005년 본 연구책임자가 최초로 발견한 이래로 염증성 사이토카인 또는 세포 사멸을 유도하는 것으로만 밝혀져 왔음. 하지만 최근 생체 실험에서 IL-32는 초기 면역 반응 유도뿐만 아니라 후기 면역 반응에서 회복을 유도하는 중요한 기능이 있는 것으로 확인됨. 본 연구는 IL-32의 정확한 생리적 기능을 밝힘으로써 현재 진행되고 있는 기존의 연구 방향과 다른 관점을 부여하여 IL-32의 새로운 연구 방향을 제시함. 현재까지 IL-32는 여러 질병들과 관련된 것으로 보고되고 있고 또 면역 세포의 분화와도 연관된 것으로 알려져 있으나, 아직 마우스에서 유전자가 발견되지 않아 정확한 생체 내 기능과 작용을 밝히는데 한계가 있음. 본 연구진은 사람의 IL-32 이성질체 중 가장 높은 활성을 갖는 IL-32γ 유전자를 도입한 형질전환 마우스를 이용하여 in vivo 상에서 나타나는 IL-32의 정확한 생리학적 기능을 규명함.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 3
2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 4
가. IL-32γ Tg 마우스 특 ... 4
나. 부분적인 간 절재 수술한 IL-32γ Tg 마우스에서 간 재생 능력의 약화 ... 4
다. 부분적 간 절재 수술 후에 혈청내 간 효소 수치 변화 ... 5
라. 부분적 간 절재 수술한 IL-32γ Tg 마우스에서 간세포 성장 인자 (HGF)의 발현과 활성 감소 ... 6
마. 부분적 간절재 수술한 IL-32γ Tg 마우스의 간에서 염증성 싸이토카인 발현량의 감소 ... 7
바. IL-32γ 과발현은 부분적 간절재 수술로 유도된 STAT3, NF-κB 신호전달 억제 ... 8
사. LPS 자극시킨 IL-32γ Tg 마우스에서 TNFα와 IL-6 발현 감소 ... 9
아. Salmonella LPS를 이용한 패혈증 모델에서 IL-32γ의 일시적 항염증 기전 ... 9
자. ConA를 이용한 간염 모델에서 IL-32γ Tg 마우스의 성별에 영향에 따른 대조적인 면역 반응 ... 10
차. MEF 세포에서 poly I:C, Vesicular stomatitis virus (VSV) 감염에 따른 면역 반응 조사 ... 15
카. VSV 처리한 IL-32γ 형질전환 마우스의 비장세포에서 항바이러스 인자 분석 ... 15
타. IL-32γ 플라스미드와 VSV 주사한 야생형 마우스의 비장세포에서 인터페론 분석 ... 16
파. VSV 감염후 비장의 백색속질 비대화 ... 16
3. 연구개발결과의 중요성 ... 17
4. 참고문헌 ... 17
5. 연구성과 ... 18
대표적 연구실적 ... 23
끝페이지 ... 36

표/그림 (18)

표 The comparison of hepatic features between WT and IL-32g TG mice. (A) Measurement of the liver/body weight ratios in 12-week-old WT and IL-32g TG mice. The animals were weighed, sacrificed and liver weights recorded. Data show the averages of liver to body weight ratio, calculated as noted in Materials and Methods (n = 9). (B) The serum level of liver enzymes. These were measured in sera from WT and IL-32g TG mice according to Materials and Methods (n = 9). Each bar represents a mean value ± SEM (n = 9 per groups). **, p < 0.01; *, p < 0.05, wild versus IL-32g TG mice. Representative data from three independent experiments are shown
표 The comparison of liver regeneration between WT and IL-32g TG mice after 70 % partial hepatectomy (PHx). (A) Liver regeneration after PHx. WT (●) and IL-32g TG (■) mice were sacrificed at the indicated times following PHx. Values are means ± SEM. ***, p < 0.001 wild vs. IL-32g TG mice. Eight mice per groups were examined at each point. (B) Histomorphometric quantification of nuclei positive for BrdU in regenerating livers of WT and IL-32g TG mice. (C/D) Sections from livers harvested at 36 hours after PHx were stained for BrdU incorporation. Shown are the mean values with their SEM. (9 mice per groups; ***, p < 0.001). Representative microscope pictures of BrdU-stained liver sections (Magnification, 200 x). Isotype-matched control mouse IgG was used for control Ab. Representative data from three independent experiments are shown
표 The serum AST and ALT levels after PHx in WT and IL-32g TG mice. ALT (A) and AST (B) enzymatic activities were determined on sera from WT and IL-32g TG mice, at various times after PHx. Values are expressed as the mean ± SEM (n = 9 per groups). *, p < 0.05, wild vs. IL-32g TG mice. Representative data from three independent experiments are shown
표 Hepatocyte growth factor (HGF) and IL-32γ expression in livers of WT and IL-32g TG mice before and after PHx. (A) Spontaneous expression of HGF in livers from WT and IL-32g TG mice before surgery. Expression profile of HGF mRNA was analyzed by RT-PCR. GAPDH mRNA was amplified together and used as control. (B) Expression and activation of HGF during liver regeneration. HGF protein was analyzed by Western blotting in liver extracts from WT and IL-32g TG that were sacrificed at 0, 1, 6 and 24 hours after liver resection. GAPDH was used as loading control. At the indicated times after PHx, the tissue extracts were isolated and subjected to western blotting (C) and sandwich ELISA (D) using IL-32 antibody. Values are means ± SEM. (n =9 per group). *, p < 0.05. Representative data from three independent experiments are shown
표 Quantification of cytokine levels in regenerating livers from WT and IL-32g TG mice after PHx. WT and IL-32g TG mice were sacrificed at the indicated times following liver resection and liver proteins were extracted as described in Materials and Methods. TNFα (A), IL-6 (B), IFNγ (C) and MIP-2 (D) were determined using ELISA respectively. Data are means ± SEM (n = 9 per groups). *, p < 0.05. Representative data from three independent experiments are shown
표 The activation of signaling pathways in livers from WT and IL-32g TG mice underwent PHx. At the indicated times after PHx, livers were sampled, and total proteins from each sample was subjected to Western blotting analyses for the activation of signaling related proteins. GAPDH was used as loading control. Representative data from three independent experiments are shown
표 Quantification of proinflammatory cytokine levels in livers from WT and IL-32g TG mice after LPS injection. WT and IL-32g TG mice were given LPS at a dose of 3 mg/kg. TNFα (A) and IL-6 (B) were determined using ELISA respectively. Data are means ± SEM (n = 9 per groups). *, p < 0.05. Representative data from three independent experiments are shown
표 Quantification of cytokine levels in salmonella LPS treated WT and IL-32g TG mice sera. WT and IL-32g TG mice were sacrificed at the indicated times and sera were collected. IL-6, IFNγ, TNFα and IL-1α were determined using ELISA respectively. Data are means ± SEM (n = 7 per groups). *, p < 0.05. Representative data from three independent experiments are shown
표 Quantification of cytokine levels in ConA induced hepatitis of WT and IL-32g TG female mice. WT and IL-32g TG female mice were sacrificed at the indicated times and sera were collected (A). After 24 hours, liver proteins were extracted with lysis buffer (B). IL-6, TNFα and IL-10 were determined using ELISA respectively. Data are means ± SEM (n = 7 per groups). *, p < 0.05. Representative data from three independent experiments are shown
표 Quantification of IL-32 concentration in ConA induced hepatitis of IL-32g TG female mice. IL-32g TG female mice were sacrificed at the indicated times and sera were collected (A). After 24 hours, liver and spleen proteins were extracted with lysis buffer (B). IL-32 was determined using ELISA. Data are means ± SEM (n = 7 per groups). Representative data from three independent experiments are shown
표 Quantification of cytokine levels in ConA induced hepatitis of WT and IL-32g TG male mice. WT and IL-32g TG male mice were sacrificed at the indicated times and sera were collected (A). After 24 hours, liver proteins were extracted with lysis buffer (B). IL-6, TNFα and IL-10 were determined using ELISA respectively. Data are means ± SEM (n = 7 per groups). *, p < 0.05. Representative data from three independent experiments are shown
표 Quantification of IL-32 concentration in ConA induced hepatitis of IL-32g TG male mice. IL-32g TG male mice were sacrificed at the indicated times and sera were collected (A). After 24 hours, liver and spleen proteins were extracted with lysis buffer (B). IL-32 was determined using ELISA. Data are means ± SEM (n = 7 per groups). Representative data from three independent experiments are shown
표 Quantification of cytokine levels in ConA induced hepatitis of WT and IL-32g TG mice sera. WT (A) and IL-32g TG (B) mice were sacrificed at the indicated times and sera were collected. IL-6, TNFα and IL-10 were determined using ELISA respectively. Data are means ± SEM (n = 7 per groups). **, p < 0.01; *, p < 0.05. Representative data from three independent experiments are shown
표 Quantification of cytokine levels in ConA induced hepatitis of WT and IL-32g TG mice liver. WT (A) and IL-32g TG (B) mice were sacrificed at 24 hours. Liver proteins were extracted with lysis buffer. IL-6, TNFα were determined using ELISA respectively. Data are means ± SEM (n = 7 per groups). Representative data from three independent experiments are shown
표 RT-PCR of IFNβ from poly(I:C) or VSV treated MEF cells of IL-32 gamma Tg mice
표 RT-PCR of IRFs from WT and IL-32γ Tg mice
표 RT-PCR of IFNs from VSV infected mouse spleen after hydrodynamic injection of IL-32 γ plasmid
표 VSV infection and white pulp staining

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