[보고서]전단 스트레스에 의한 심방 근세포 자발성 Ca2+ 유리 기전 규명:  phospholipase C 상위 신호전달 고찰

우선희

보고서 정보

주관연구기관

충남대학교
Chungnam National University

연구책임자

우선희

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2018-05

과제시작연도

2017

주관부처

과학기술정보통신부
Ministry of Science and ICT

과제관리전문기관

한국연구재단
National Research Foundation of Korea

등록번호

TRKO201900023337

과제고유번호

1711052349

사업명

개인기초연구(미래부)

DB 구축일자

2020-08-01

키워드

전단 스트레스.심방 근세포.길이방향 칼슘 웨이브.ATP 세포 유리.퓨린작동성 수용체 아형.컨넥신 채널.공촛점 칼슘 이미징.리포터 패치클램프.부정맥.

표 본 연구에서 밝히고자 하는 심방 전단자극 신호전달 가설. 붉은색으로 표시한 내용은 본 연구과제에서 해결하고자 하는 주 의문점임
표 ATP 분해효소 apyrase(2 U/ml)에 의해 전단자극으로 유도되는 Ca2+ 웨이브가 억제됨. A는 공촛점 칼슘이미지로 전단자극에 의하여 발생된 길이방향의 웨이브를 보여줌. 약물 처리 후 전단자극을 처리해도 웨이브가 발생하지 않음. B는 각 지정영역에서의 Ca2+ 농도 변화를 나타냄. C, D, 웨이브 빈도, Ca2+ 농도 변화의 통계 (n=9). *P<0.05, **P<0.01 vs Control
표 간극접합 해미채널 억제에 의한 전단자극 유발 L-웨이브의 억제. A. 전단자극처리 시 길이방향 웨이브 발달. 우측: carbenoxolone 처리 후 전단자극 시 기록된 영상. B. 약물 처리 전과 후에 전단자극 처리 시 기록된 국부 Ca2+ trace 및 세포 전체 Ca2+ trace(검은색). 화살표는 Ca2+ 증가 onset, 영상에서 0 s와 일치. Inset: ROI. C. 8초 자극 시 웨이브 발생횟수(좌). Ca2+ trace의 peak 값 비교. n=6. *P < 0.05, ***P < 0.001 vs. control(paired t test)
표 세포 외액 Ca2+ 제거 시 전단자극 유발 L-웨이브 발생의 항진. A. 세포 외 Ca2+ 제거 후, 전단자극(shear) 처리시 발달되는 웨이브. 좌측: 패널 B, a 시점에 기록. 우측: b 시점에 기록된 것임. B. 세포 외 Ca2+ 제거 시 전단자극 처리에 의해 나타난 세포 전체 Ca2+ 증가 신호(위) 및 국부 Ca2+ 신호(아래). 화살표는 Ca2+ 증가 onset: 영상에서 0 s. Inset: ROI. D, 평균 웨이브 발생 빈도: 세포 외 2 mM(n=64), 0 mM(n=6) Ca2+. 세포 전체 Ca2+ trace의 peak 값 비교(우). **P<0.001 vs. “2 mM Cao”. (unpaired t test)
표 Cl- 채널 억제는 전단자극-유발 L-웨이브 발생을 억제하지 않음. A. 전단자극(shear) 처리 시 웨이브. 우측: 9-AC 처리 후 전단자극 시 기록된 영상. B. 약물 처리 전과 후에 전단자극 처리 시 기록된 국부 Ca2+ trace(초록, 보라) 및 세포 전체 Ca2+ trace(검은색). Inset: ROI. 화살표는 Ca2+ 증가 onset을 나타내며 영상에서 0 s와 일치. C. 8초 동안의 자극 처리 시 발생된 웨이브 발생 횟수를 약물 처리 전과 후에 비교한 그래프(좌). 세포 전체 Ca2+ trace의 peak 값 비교. (P>0.05, paired t test, n=4)
표 Maxi 음이온 채널은 전단자극 유발 L-웨이브 발생에 관여하지 않음. A. 전단자극(“shear”) 처리 시 길이방향으로 발달되는 웨이브. 우측: 50 uM Gd3+ 처리(5분) 후 전단자극 시 기록된 영상. B. 약물 처리 전과 후에 전단자극 처리 시 기록된 국부 Ca2+ trace 및 세포 전체 Ca2+ trace(검은색). 화살표는 Ca2+ 증가 onset. Inset: ROI. C. 8초 동안의 자극 처리 시 발생된 웨이브 발생 횟수를 약물 처리 전과 후에 비교한 그래프 (좌). 세포 전체 Ca2+ trace의 peak 값 비교. P>0.05, paired t test, n=5
표 Luciferin-luciferase 반응을 이용해 측정된 전단자극에 의한 심방세포 ATP 유리 및 그 기전. A) 10초간 전단자극을 가하고 2초간격으로 세포외액의 ATP농도를 측정하여 세포 면적으로 보정한 값. 일시적 증가를 보임. B) 전단자극 강도의 효과. C) pannexin 억제 효과. D, E) 커넥신 항진 및 억제 효과. F) 세포외 유출, 맥시음이온 채널, 염소이온채널 억제 효과
표 P2 퓨린 수용체 억제제 suramin(10 μM)에 의해 전단자극으로 유도되는 Ca2+ 웨이브가 억제되었음(예비 연구). A는 공촛점 칼슘이미지로 전단자극에 의하여 발생된 길이 방향의 웨이브를 보여줌. 약물 처리 후 전단자극을 처리해도 웨이브가 발생하지 않음. B는 각 지정영역에서의 Ca2+ 농도 변화를 나타냄. C, D, 웨이브 빈도, Ca2+ 농도 변화의 통계 (n=15). *P<0.05 vs Control
표 P2X 퓨린 수용체는 전단자극시 L-웨이브 유발에 기여하지 않음. A. 10 μM iso-PPADS 처리 전과 후 전단 자극 시 발생된 길이방향 웨이브. B. 각각 기록된 국부 Ca2+ trace 및 세포 전체 Ca2+ trace(검은색). 화살표는 Ca2+ 증가 onset. Inset: ROI. C. 8초 동안의 자극 처리 시 발생된 웨이브 발생 횟수를 약물 처리 전과 후에 비교한 그래프 (좌). 세포 전체 Ca2+ trace의 peak 값 비교(1 μM, n=4; 10 μM, n=7, 100 μ M; P>0.05, paired t test, n=4)
표 전단 자극 시 심방세포 길이 방향 Ca2+ 웨이브가 P2Y1 퓨린 수용체를 매개로 발생됨. A. 200 nM MRS 2179 처리전과 후에 전단자극 시 발생된 웨이브. B. 각각 기록된 국부 Ca2+ trace(초록, 보라) 및 세포 전체 Ca2+ trace(검은색). 화살표는 Ca2+ 증가 onset을 나타내며 영상에서 0 s와 일치. Inset: ROI. C. 8초 동안의 자극 처리 시 발생된 웨이브 발생 횟수를 약물 처리 전과 후에 비교한 그래프(좌). 세포 전체 Ca2+ trace의 peak 값 비교. *P<0.05, paired t test, n=8
표 전단자극에 의해 발생되는 심방근세포 길이방향 세포 Ca2+ 웨이브에 대한 SAC(A), NCX(B), Nox(C), TRPM4(D)의 역할고찰. a: 공촛점 영상으로 각 단백질 억제제 처리 후 관찰된 길이방향 Ca2+ 웨이브를 보여줌. b: 웨이브 발생지점 및 진행 지점에서 측정된 Ca2+ 신호 변화. inset은 ROI. 화살표는 이미지의 0 s 와 일치. E: 물질들에 의한 효과를 전단자극에 의해 유도된 웨이브의 평균 발생 빈도에 대하여 비교 정리한 그래프. Control: n=64; GsMTx-4: n=7; KB-R7943: n=6; DPI: n=5; 9-PT: n=7
표 미토콘드리아 Na+-Ca2+ 교환체는 전단자극 유발 L-웨이브 발생에 관여하지 않음. A. 1 uM CGP-37157 처리(1 분) 후 전단자극 시 기록된 영상. B. 약물 처리 후에 전단자극 처리 시 기록된 국부 Ca2+ trace(초록, 보라) 및 세포 전체 Ca2+ trace(검은색). Inset: ROI. 화살표는 Ca2+ 증가 onset을 나타내며 영상에서 0 s와 일치. C. 8초 동안의 자극 처리 시 발생된 웨이브 발생 횟수를 약물 처리 전과 후에 비교한 그래프(좌). 세포 전체 Ca2+ trace의 peak 값 비교. P>0.05, paired t test, n=6
표 미토콘드리아 기능은 전단자극 유발 L- 웨이브 발생에 관여하지 않음. A. 좌측 공촛점 Ca2+ 영상은 전단자극(shear) 처리 시 길이방향으로 발달되는 웨이브를 나타냄. 우측: 1 μM CCCP(미토콘드리아 uncoupler)+1 μg/ml oligomycin(F1/Fo ATP synthase 억제제) 처리(5-6분) 후, 전단자극 시 기록된 영상. B. 약물 처리 전과 후에 전단자극 처리 시 기록된 국부 Ca2+ trace(초록, 보라) 및 세포 전체 Ca2+ trace(검은색). 화살표는 Ca2+ 증가 onset을 나타내며 영상에서 0 s와 일치. Inset: ROI. C. 8초 동안의 자극 처리 시 발생된 웨이브 발생 횟수를 약물 처리 전과 후에 비교한 그래프(좌). 세포 전체 Ca2+ trace의 peak 값 비교. P>0.05, paired t test, n=4
표 정상 심방세포에서 관찰된 전단자극-유발 길이방향 웨이브와 이 웨이브에 의한 Ca2+ signaling의 변형. A, 1 Hz 전기자극(16 dyn/cm2)을 심방세포에서 전단자극 처리 전(a)과 후(b: 처리 직후; c: steady state)에 기록된 공촛점 Ca2+ 영상. B에서 번호 또는 막대로 표시된 각 시점에서 기록된 영상임. B, 공촛점 Ca2+ 영상에서 측정된 whole-cell Ca2+ transients. C, ROI에서 측정된 국부 Ca2+ 신호. A-b에 번호로 표시된 영상은 동일 번호로 표시된 시점에 기록 되었음. L-웨이브 전파를 잘 반영함. D, 전단자극 처리 직후(SS, 1st beat)와 안정기(SS, steady)에서 측정된 Ca2+ transient 크기의 비교. *P<0.05, **P<0.01 vs. Control. ###P<0.001 vs. “SS, 1st beat”. n=8(paired t test)
표 형광지시약 확산원리를 이용한 전단자극에 의한 커넥신 해미채널 기능 활성화의 검증. A, 2 mM Cao(control)(n=16), 0 mM Cao(n=9), 2 mM La3+(n=7), 800 μM probenecid(n=6)를 각각 처리한 쥐 심방세포에서 전단자극 처리 전과 후에 기록된 calcein red/orange 공촛점 형광영상. B, 각 조건에서 형광 변화 비의 시간에 대한 plot. C, 분당 형광 변화율의 평균값 비교. **P<0.01, ***P<0.001 vs. Con(control)
표 형광지시약 확산원리를 이용한 전단자극에 의한 커넥신 해미채널 기능 활성화의 검증. A, 전단자극 시 oregon green 및 calcein 형광 지시약 세포외 유출 비교. B, 전단자극 처리 전과 후에 쥐 심방세포에서 기록된 oregon green 공촛점 형광 영상. C, 전단 자극에 의한 calcein(n=16), oregon(n=15) 세포외 유출 평균값 간 비교. **P<0.01 vs. calcein
표 형광지시약 확산원리를 이용한 전단자극에 의한 커넥신 해미채널 기능 활성화의 검증. A, 전단 자극 시 심방세포주 HL-1 세포의 밖에서 안으로 lucifer yellow(LY)의 확산이 일어난 모습(오른쪽 이미지). B, 전단 자극 처리 전과 후 LY 형광 강도의 평균 변화량. **P<0.01 vs. control. 6 HL-1 세포 batches
표 전단 자극에 의해 발생되는 심방근세포 전류에서 컨넥신 채널의 주된 역할. (A와 B) A, 세포 내외 동일한 CsCl용액을 사용하여 –70 mV에 전단자극에 의해 활성화 된 내향전류는 세포 외 Ca2+으로 억제되고, carbenoxolone(50 uM)으로 억제됨. 세포 안팎 동일 농도의 Cs+ 조건에서 기록된 전단자극-유도 Cs+ 내향전류(IS,Cs)는 Cs+을 NMDG+로 치환한 후 약 75% 감소함(IS,NMDG, 외액: 137 mM NMDG·Cl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 10 glucose; 내액: 137 mM NMDG·Cl, 10 HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM MgATP). 동일 조건에서 전단자극-유도 내향전류는 간극접합 해미채널을 활성화시키는 quinine(100 μM)을 처리하였을 때 약 70% 증가하였고, 억제제인 La3+(2 mM)을 처리하였을 때 대부분 소실됨. ****P < 0.0001 vs. control, Cs+. ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs. control, NMDG+. (C) 세포 안팎 동일 농도 NMDG+ 조건에서 전단자극에 의해 활성화되는 전류는 전압의존적 변화(좌). 이 전류는 평균적으로 직선형 전압의존성을 보이고 약 0 mV에서 역전됨 (n=5)
표 전단자극 시 활성화되는 내향전류에 대한 P2X 수용체, (P2Y1-)TRPM4 전류의 역할. (A와 B) 심방세포에서 전단자극에 의해 활성화되는 전류에 대한 P2(10 μM suramin; n = 4), P2X 억제제(iso-PPADS 30 μM; n = 6) 효과. (C와 D) TRPM4 채널 억제제 9-phenanthrol(9-PT, 10 μM, n = 6) 효과 및 이물질과 P2Y1 억제제 MRS2179(0.2 μM) 동시 처리(n = 5) 효과. (E) 약물효과 요약. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001 vs. control
표 HL-1 심방세포주에서 전단자극에 의한 ATP 분비(A) 및 이에 대한 배양 밀도(confluence)의 영향(B)
표 전단자극에 의한 심방세포 커넥신 43 해미채널의 활성화 및 이로인한 ATP유리 및 전도성 변화. A) siRNA를 사용한 HL-1 심방세포 Cx43 넉다운. Western blotting 결과. B 와 C) Cx43 넉다운(n=4, batches) 또는 Cx43 해미채널 억제(gap19; 4 batches) 시 전단 자극에 의한 HL-1 세포 ATP 분비의 억제. **P < 0.01 vs. WT(B) or control(C). D) 대조군(WT, n=7)과 커넥신 43 넉다운(Cx43 KD; n=8) HL-1 세포군에서 전단자극 시 활성화되어 커넥신 해미채널로부터 매개되는 전류 비교. 세포 안팎 동일 NMDG+ 농도 조건에서 전류 기록. WT HL-1 세포에서 전단자극은 내향전류를 발생시켰고, 이는 100 μM quinine 에 의해 유의성 있게 증가함. *P < 0.05 vs. control. ##P < 0.01 vs. WT, control. E) 커넥신 43 항체를 쥐 심방근세포 내로 도입하여 전단자극에 의해 활성화되는 전류의 억제가 관찰됨(n=8). 대조군은 항원 항체 투석 그룹(control; n=6). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001 vs. control
표 HL-1 심방세포주에서 커넥신 40 부분적 넉다운(우)이 전단 자극에 의한 ATP 유리(좌; x축 단위: 초)에 미치는 영향 고찰
표 pcDNA3.1/GFP 벡터에 P2X7를 cloning한 과발현 벡터 예상 모식도
표 P2X 수용체를 과발현하는 리포터 세포(HEK293 세포) 제작 및 검증. 흰쥐 P2X7 cDNA 클론 (Origine, pCMV6-entry vector)를 AcGFP가 삽입되어 있는 pcDNA3.1/Zeo vector에 재조 합하여 삽입한 후 HEK293 세포에 6 시간 transfection(4, 15 ug/ml; DNA:lipofectamine=1:1) 후 이틀 뒤 실험 신행. (A) 발현 후 GFP 관찰 (B) PCR 로 과발현된 P2X7 수용체 mRNA 관찰. (C) Western blot으로 transfection 양에 따른 P2X7 수용체 단백 발현 증가 관찰
표 P2X7 과발현 HEK 세포에서 ATP 의존성 전류 기록. (A) -70 mV에서 ATP 로 유도된 내향 전류. (B) 전류의 최대치와 ATP 농도 관계 곡선(Hill eq. fit, EC50=3.3±2.1 μM; n=32)
표 P2X7 수용체 과발현 HEK 세포에서 P2X 전류 검증. P2 억제제 (suramin, sur)로 전류가 억제됨(n=7). GFP 만 발현되는 세포(n=15)에서 ATP 효과는 미미함. -70 mV
표 전단자극 시 심방근세포 ATP 분비 후 Ca2+ 웨이브가 발생됨. (A) 전단자극으로 유발된 길이방향 Ca2+ 웨이브(좌) 및 횡방향 빠른 웨이브(우). (B) 기록된 세포에서 촬영한 리포터 패치 피펫 및 심방근세포 모습. 그림 (좌)에서는 길이방향 Ca2+ 신호 측정(D)을 위해 웨이브 시작지역 및 중반이상 진행 지점에서 ROI 지정함(C). 동시에 측정된 전류(Blue trace)는 HEK293 세포 P2X7 전류임(그림 (좌)D, 그림 (우)C). 그림 (우)에서는 횡방향의 세포 웨이브 발생을 잘 보여주기 위해, 세포 주변부(red) 및 중심부(green)에서 Ca2+을 측정함(C upper, B right). 그림 (좌)E, 그림 (우)D: 웨이브 발생 시기에 확대한 Ca2+ 및 전류 신호
표 전단 자극에 의한 활동전위(Vm) 유발과 잇달아 일어나는 횡방향 Ca2+ 웨이브(이미지). 붉은색 및 초록색 세포영역(이미지 오른편)은 주변부 (peripheral) 및 중심부(central) Ca2+ 측정에 사용된 ROI. 푸른색 trace위에 표시된 붉은 막대 기간동안 측정된 국부 Ca2+ 및 막전위(inset). 정상 Tyrode 용액을 사용하였고 whole cell patch clamp를 0.02 mM EGTA, 0.1 mM fluo-4가 포함된 세포 내액을 사용함
표 전단자극에 의한 횡방향 Ca2+ 웨이브는 P2X 수용체 활성에 의함. a: 전단자극 시 발생되는 횡방향 웨이브 (control)와 이에 대한 suramin(10 uM)의 억제 효과. 주변부 및 중심부 Ca2+ 신호를 (B)에 나타냄. (C)는 각 조건에서 발생되는 웨이브 평균 발생 빈도(spikes/s) 및 국부 Ca2+ 증가량. b: 전단자극에 의해 발생되는 횡방향 웨이브에 대한 iso-PPADS의 억제 효과. ****P<0.0001, ***P<0.001 vs. control
표 본 연구의 결론 및 병태생리학적 의미

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