[보고서]TRPC 이온통로와 사구세 손상에 관한 연구 - TRPC 구조와 기능 조절에 관한 연구

이규필

TRPC 이온통로와 사구세 손상에 관한 연구 - TRPC 구조와 기능 조절에 관한 연구
Study of TRPC channel in glomerular injury; strucutre - functional relation of TRPC 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	충남대학교 Chungnam National University
연구책임자	이규필
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2018-11
과제시작연도	2017
주관부처	교육부 Ministry of Education
등록번호	TRKO201900025235
과제고유번호	1345272278
사업명	개인기초연구(교육부)
DB 구축일자	2020-08-29
키워드	신장질환.TRP 이온통로.칼슘.단백질 구조.전기생리학.

초록 ▼

□ 연구개요
신장질환에서 TRPC를 통한 사구체 발세포에서의 칼슘신호전달의 기전을 이해하고, TRPC6 획득-기능 변이연구를 통하여 TRPC의 3차구조에 대한 지식을 축적한다.
TRPC 아형 상호간의 interaction의 사구체 발세포의 endogenous수준에서 확인하며, 세포내 칼슘 항상성 조절에 중요한 역할을 TRPC channel을 포함하는 ‘Signalplex’를 탐색한다. 이를 토대로 TRPC channel을 타겟으로하는 renal protecitve요법을 확립하여 신장질환의 새로운 접근법을 모색

□ 연구 목표대비 연구결과
3년간의 과제수행을 통하여 다음의 연구를 목표로 하였다.
① TRPC6 channel의 기능-획득 변이의 전기생리학적 기전을 규명하고, TRPC channel의 사구체 발세포주에서의 발현 및 그 기능을 탐색하고,
② Diabetic nephritis 모델동물에서의 TRPC의 역할에 관한 연구 와 사구체 발세포주에서의 TRPC/STIM1의 기능을 규명하며
③ 모델동물에서의 TRPC 의 역할을 연구하여 TRPC에 의한 신부전모델동물을 확립하고 핵심 유전자 탐색하고자 하였다.
연구수행을 통하여 TRPC6 기능-획득 변이의 전기생리학적 기능조절의 특성을 파악하고, 최근 밝혀진 TRPC 3차구조와의 연관성을 토대로 Gating 모델을 제시하였다. 이러한 성과를 in vivo, in vitro상에서 확인하기 위한 동물모델실험을 계속 수행하고 있다.

연구개발결과의 중요성
1. TRPC6 채널 활성 조절의 분자 기전 규명 및 원천 지식 확보
2. 다른 TRP channel 아형들과의 구조적 유사성을 통한 기능 연구로서의 확대
3. TRPC channel들을 타겟으로 하는 신약물질 선정을 위한 이론적 배경마련
4. 기초연구를 통해 얻어진 지식들을 바탕으로 새로운 질환 치료제 개발을 위한 drug screening 시스템을 활용할 수 있고, 치료 전략 수립에 이론적 토대를 제공

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
1) 1차년도 연구계획 (2015~2016) ... 5
2) 2차년도 (2016-2017) ... 5
3) 3차년도 (2017-2018) ... 5
2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 5
3. 연구개발결과의 중요성 ... 8
4. 참고문헌 ... 9
5. 연구성과 ... 10
끝페이지 ... 11

표/그림 (6)

표 사구체 발세포의 세극막에서의 TRPC의 in situ 발현. TRPC6 gain-offunction변이 channel에서 칼슘에 대한 투과도가 증가. N-말단, C-말단에서 관찰되는 변이에서 유사한 형태를 보인다
표 TRPC6 FSG Mutants display GOF calcium carrying current amplitudes that lead to Podocyte damage. (A) Average current density of rTRPC6wt and all FSG mutants reported up to date. (B) FSG mutants damage podocytes compared to wild type TRPC6
표 CDI of TRPC6 is dependent on internal free calcium level. (A) Continuous traces representing the effects of external calcium on TRPC6wt (top), N019H (middle) and R894C (bottom) from a minimal 0.1mM [Ca2+]0 to 10mM [Ca2+] at strong internal Ca2+ (Cai 2+)-buffering conditions (10 BAPTA). (B) Relationships between relative TRPC6 (wt in black, NT mutant in red, CT mutant in blue) amplitude (fold change) and [Ca2+]0 at strong internal Ca2+ (Cai 2+)-buffering conditions (10 BAPTA). (C) Effect of external calcium on wt TRPC6(top), N109H (middle) and R894C (bottom) from a minimal 0.1mM [Ca2+]0 to 10mM [Ca2+]0 under weak intracellular Ca2+ (Cai 2+)-buffering conditions (1 BAPTA). (D) Relationships between relative TRPC6 (wt in black, NT mutant in red, CT mutant in blue) amplitude (fold change) and [Ca2+]0
표 CDI of TRPC6 is CaM Dependent . Hindering the CaM-TRPC6 interacting site R864 resulted in increased inward current (A) and lack of CDI (B) which is similar to that of FSG mutants. YQ site mutant Q855E nor CaM/ Phosphoinositide binding site mutant R852A did not yield a change in a significant increase in inward current or CDI. (D) CDI of TRPC6 increases with the increasing equilibrium dissociation constants of the complex of TRPC6 WT and its mutants with CaM. Co-transfection of CaM C lobe or N lobe deletion mutant could reverse gain of function of CT FSG mutant R894C in conventional whole cell (E) and perforated whole cell (F) conditions
표 Lack of CDI and gain of function current amplitudes are exclusive to the FSG mutants located at NT-CT interaction sites of TRPC6. (A) All GOF mutants except for A403V is located very close to (<5A0) NT-CT interface of TRPC6. (B) Side view (Left) and bottom view (right) of hTRPC6 crystal structure (FSG mutation sites are marked in green and pointed with white arrows). (C) Putative interaction sites (side chains marked with sticks) for FSG mutations (FSG sites marked in red & all distances are measured in A0). (D) Cartoon structure of TRPC6 color coed with NT AKR in blue, AKR-TM linker in cyan, TM region in magenta, pore helixes in brown, CIRB domain in yellow and CT CCD domain in red. FSG mutation sites are marked in green and CaM/IP3 binding regions marked in black. (interaction sites mentioned at B marked at relevant locations). . (E) Truncating the CT of TRPC6 up to the NT-CT interaction site does not yield any gain of function, however, truncating TRPC6 beyond the NT-CT interaction site will result a GOF similar to that of FSG mutation. Further Trimming of TRPC6 beyond the NT-CT interaction renders the channel inactive
표 CT FSG mutation site Q888 interacts with NT Y107 to result calcium dependent inactivation of TRPC6 and Salt bridge between FSG mutation site R894 and E146 stabilizes the NT AKR with CT CCD. (A) Relative calcium dependent inhibition (CDI) of TRPC6 shows a co-relationship to the hydrophobicity of a the amino acid at Q888 site (top). (B) Introducing hydrophobic Isoleucine at Q888 resulted in a decreased CDI. However, introduction of aromatic Tryptophan and Phenylalanine increased the CDI to a level even higher than that of wild type channels. (C) Q888K FSG mutant displays a strong gain of function with the lack of CDI. However, interlocution of negatively charged Glutamic acid at Y107 site reveres the gain of function of Q888K FSG mutant (D) Introduction of hydrophobic mutations at Q888 site does not change the calcium carrying current amplitudes. (E) Gain of function phenotype of CT R894 mutants display a strong relationship with the hydrophobicity of the R894 site. Positively charged R894 site displays a strong relationship with the charge of the side chain as well. This indicates a salt bridge interaction with another negatively charged site. (F) Introduction of complementary charges (positive & negative) at E146 & R894 sites restored the CDI except the E146R R894E double mutant. (G) Traces representing the CDI of wt (top) which is lost when R894E mutation is introduced (middle) which is again recovered when E146K mutation is introduced to the NT. (H) Introducing the E146K mutation reverses the increased current amplitude of R894E mutant

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