초록 ▼

□ 연구개요
구리독성에 가장 치명적인 영향을 받은 기관은 엽록체이다. 그러나 지금까지 엽록체의 산환환원 단백질인 Trxm과 과잉에 의한 구리독성과의 상호관계 및 방어기작 메카니즘에 관한 연구가 전혀 없었다. 그래서 구리독성에 대한 엽록체의 Trxm의 방어 기작 메카니즘에 대한 연구를 함으로써 식물이 구리독성에 어떻게 반응하고 방어하는지에 대한 기작을 밝히고자한다. 이런 연구를 통해서 중금속에 오염된 토양정화에 있어서 식물환경정화기술을 응용 할 수 있고 중금속에 오염된 토양에서 저항성을 가지는 형질전환작물체 (수도)개발 및 작물

□ 연구개요
구리독성에 가장 치명적인 영향을 받은 기관은 엽록체이다. 그러나 지금까지 엽록체의 산환환원 단백질인 Trxm과 과잉에 의한 구리독성과의 상호관계 및 방어기작 메카니즘에 관한 연구가 전혀 없었다. 그래서 구리독성에 대한 엽록체의 Trxm의 방어 기작 메카니즘에 대한 연구를 함으로써 식물이 구리독성에 어떻게 반응하고 방어하는지에 대한 기작을 밝히고자한다. 이런 연구를 통해서 중금속에 오염된 토양정화에 있어서 식물환경정화기술을 응용 할 수 있고 중금속에 오염된 토양에서 저항성을 가지는 형질전환작물체 (수도)개발 및 작물체를 이용하여 중금속오염지역에서의 수도의 생산성증가 및 벼 종자품질을 향상시키는데 도움을 줄 것이다. 특히 수도 OsTrxm을 이용한 형질전환작물체 개발은 구리독성뿐만 아니라 다른 환경스트레스에 저항성을 가지는 내재해성 식물체 개발에 이바지 할 것이다.

□ 연구 목표대비 연구결과
수도에서 구리독성에 대한 엽록체 산화환원단백질인 OsTrxm의 방어기작 메카니즘에 대한 연구를 위해서 우선 RT-PCR을 이용하여 애기장대와 수도의 AtTrxm1, AtTrxm2, AtTrxm4, OsTrxm 유전자들 분리하였다. 또한 구리 의존적으로 Trxm의 기능 및 구조변화를 알아보기 위해서 대장균 시스템을 이용하여 애기장대와 수도 Trxm들의 재조합 단백질을 순수분리 하였다. 이 재조합 단백질을 이용하여 Reduction activity, Chaperone activity, Native gel을 이용한 구조변화, Size exclusion chromatography을 이용한 분자크기 및 구조변화, bis-ANS fluorescence 측정을 통한 Hydrophobicity 분석을 수행 하였다. 이 실험들을 통해서 수도 OsTrx이 구리에 의해 Oligomer를 형성했고 또한 약 10배 정도 증가된 Chaperone 활성이 있음을 밝혔다.
OsTrxm의 구조 및 Chaperone 기능 변화에 관여하는 아미노산 잔기들을 찾기 위해 서 컴퓨터 프로그램을 이용한 구조 시뮬레이션을 수행을 했다. 그 결과 구리와 결합하고 OsTrxm의 구조 및 Chaperone 기능 변화에 관여하는 아미노산 잔기들을 예측할 수 있었다. 예측된 아미노산 잔기들이 우선 in vitro에서 구리 의존적 OsTrxm의 구조 및 Chaperone 기능 변화에 관여하는지를 알아보기 위해서 예측된 아미노산 잔기를 point mutation시킨 수도 OsTrxm을 단백질을 순수분리 시켰다. 순수 분리한 재조합 수도 OsTrxm을 단백질을 가지고 구리처리 시 Insulin reduction과 chaperone activity측정했으며 또한 SEC를 통한 구조변화를 확인 하였다. 그 결과 예측된 아미노산 잔기들이 구리 의존적 OsTrxm의 구조 및 Chaperone 기능 변화에 관여한다는 것을 알 수 있었다.
그리고 in vivo내에서 즉 식물에서 예측된 아미노산 잔기들이 구리 의존적 OsTrxm 의 구조 및 Chaperone 기능 변화에 관여하는지를 알아보기 위해서 수도 OsTrxmnative (OsTrxm-3XHA, mutant (OsTrxm M78A/C119A-3XHA), 클로닝 하여 Binary vector에 ligation한 construct들을 이용하여 Agrobacterium transformation을 수행하여 형질전환식물체 (수도와 애기장대)를 구축하였다. 형질전환식물체를 이용하여 구리유무에 따라 구조변화를 보기 위해서 Native gel상에서 구조를 관찰 하였다. 그 결과 OsTrxm-3XHA 과발현 형질전환식물체에서는 구리농도 의존적으로 Oligomer가 형성되었지만은 OsTrxm M78A/C119A-3XHA 과발현 형질전환체에서는 구리농도 의존적으로 Oligomer가 형성되지 않고 단백질의 구조가 구리 유무에 따라 변화 하지 않았다. 즉 In vivo상에도 아미노산 잔기인 M78과 C119번이 구리 의존적 구조변화 및 Chaperone 기능에 큰 영향을 준다는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 구리과잉 뿐만 아니라 여러가지 환경스트레스하에서의 형질전환식물체들 (OsTrxm-3XHA과 OsTrxm M78A/C119A-3XHA)의 표현형을 관찰 중에 있고 구리 과잉에 있어 대조군에 비해 OsTrxm-3XHA 과발현 형질전환식물체에서 저항성을 가지는 표현형을 관찰 할 수 있었다.

□ 연구개발결과의 중요성
엽록체 내 존재하는 산환환원조절 단백질 Trxm이 구리독성에 어떻게 인지하고 방어하는 기작에 대한 연구는 전혀 되어있지 않다. 그래서 구리독성에 대한 식물 Trxm의 방어기작에 대한 연구결과들은 구리독성에 대한 식물의 반응연구에 하나의 모델로써 활용 할 수 있다. 중금속에 의한 토양오염은 작물의 수확량 감소를 시키며 또한 기존에 오염된 토양을 정화하는데 들었던 물리화학적 방법인 중금속의 토양세척, 전기정화는 많은 비용이 들어간다. 식물 Trxm을 이용한 중금속에 내성이 있고 중금속에 오염된 토양을 정화 할 수 있는 형질전환식물체를 개발한다면 작물의 수확량 증대 및 토양정화에 많은 비용이 절감될 것이다. 그리고 이런 형질전환식물체의 개발에 대한 원천기술에 대한 특허출원으로 지적 재산권을 획득함으로써 국가 경쟁력이 높게 올라 갈 것이다.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 4
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 4
• 2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 6
• 3. 연구개발결과의 중요성 ... 10
• 4. 참고문헌 ... 10
• 5. 연구성과 ... 12
• 끝페이지 ... 12