초록 ▼

□ 연구개요
❍ 본 연구에서는 다른 병원성과 유전형을 가진 O. tsutsugamushi 균주들의 다양한 항생제에 대한 감수성을 in vitro cell culture 모델을 통해 조사한 후 항균 효과가 가장 뛰어난 항생제를 찾고 이를 쯔쯔가무시병 질환 마우스 모델에서 적용함으로서 사망률을 줄일 수 있는 효과적인 항생제를 알아보고자 함. 이와 동시에 in vivo 마우스 model에서 진단적 방법 및 사망 예측인자로써의 real-time PCR의 유용성을 알아보고자 함

□ 연구 목표대비 연구결과
❍ 본 연구에

□ 연구개요
❍ 본 연구에서는 다른 병원성과 유전형을 가진 O. tsutsugamushi 균주들의 다양한 항생제에 대한 감수성을 in vitro cell culture 모델을 통해 조사한 후 항균 효과가 가장 뛰어난 항생제를 찾고 이를 쯔쯔가무시병 질환 마우스 모델에서 적용함으로서 사망률을 줄일 수 있는 효과적인 항생제를 알아보고자 함. 이와 동시에 in vivo 마우스 model에서 진단적 방법 및 사망 예측인자로써의 real-time PCR의 유용성을 알아보고자 함

□ 연구 목표대비 연구결과
❍ 본 연구에서는 세포감염 실험으로 확보한 O. tsutsugamushi Boryong, Karp, Gilliam, 그리고 Kato균이 감염된 L929세포와 plaque assay를 이용하여 in vitro 항균제 감수성 검사를 수행하여 다양한 항생제들에 대한 MICs(Minimum Inhibition Concentrations)를 결정하였음. In vitro감수성 검사에 이용된 항생제는 doxycycline, tigecycline, minocycline, chloramphenicol, azithromycin, rifampicin, rifaximin, ciprofloxacin, erythromycin 임. 그 결과 Azithromycin과 Minocycline은 네가지 균주에 대해서 MIC 0.0625μg/mL로 확인되었고, Tigecycline은 MIC 0.125μg/mL, Chloramphenicol은 MIC 0.5μg/mL, Ciprofloxacin은 MIC 4μg/mL, Erythromycin은 MIC 32μg/mL 이상으로 확인되었음. 또한 Rifaximin은 MIC 0.125 ~ 0.5μg/mL로 나타났으며, Rifampicin은 MIC 0.125 ~ 1μg/mL 사이로 확인되었고, Doxycycline은 MIC 0.0625 ~ 1μg/mL 로 네 가지 균주에서 서로 다른 값으로 확인되었음. 본 연구를 통해 쯔쯔가무시병 치료를 위한 적절한 항생제 후보군을 찾을 수 있었음.
❍ In vitro 항균제 감수성 검사에서 얻은 결과를 통해 항균효과가 가장 뛰어난 항생제로 임상에서 사용 중인 tigecycline, doxycycline, 그리고 azithromycin을 최종 선택하였으며, 쯔쯔가무스병 중증질환 마우스 모델을 이용하여 in vivo 항균제 감수성 검사를 수행하였음. 그 결과 O.tsutsugamushi Boryong, Karp, Gilliam, 그리고 Kato 표준 균주들을 주사한 마우스 비장에서 14dpi(day of post-infection)에는 쯔쯔가무시균 DNA가 10³~10⁵ copies/1 μg of genomic DNA로 존재하였으며, Gilliam균을 주사한 경우 가장 높은 1.2x10⁵ copies를 나타냈음. Boryong, Karp, 그리고 Gilliam균주를 주사한 마우스에 doxycycline, tigecycline, azithromycin 항생제 치료를 한경우 14 dpi(항생제 치료가 완료된 후 1 주일)에도 10²~10⁴ copies의 균 DNA가 여전히 검출되었으나, Kato균주의 경우 azithromycin 항생제 치료 후 혈액에서 균 DNA가 검출된 것을 제외하고는 다른 항생제 처리에 의해 모두 균이 사멸한 것을 확인할 수 있음. 이들 real time PCR에서 얻은 결과는 56 kDa nested PCR결과와 대부분 일치하였음. 본 연구에서는 균 주사 후 3일째부터 항생제 치료를 했음에도 불구하고 항생제 치료가 완료 된 후 1주일째에도 치료에 사용되는 항생제의 종류, 그리고 감염된 O. tsutsugamushi균에 따라 전혀 균이 제거되지 못하고 마우스의 비장과 혈액에 균이 남아있음을 O. tsutsugamushi-specific 56 kDa nested PCR과 real time PCR을 통해 확인하였음.

□ 연구개발결과의 중요성
❍ 본 연구를 통해 O. tsutsugamushi는 절대 세포 내 기생세균으로 서로 다른 병원성을 가지고 있는 Karp, Kato, Boryong, Gilliam균주에 대한 적절한 배양방법을 확립하였고 PCR 및 IFA 방법 등을 통해 증빙하였음. 또한 plaque assay를 이용하여 현재 임상에서 사용하고 있는 9개의 서로 다른 항생제에 대한 O. tsutsugamushi 의 in vitro 항균제 감수성 검사를 수행하였고 in vitro 결과에서 얻은 자료를 토대로 쯔쯔가무시병 중증질환마우스 모델을 이용 in vivo 항균제 감수성 검사를 통해 감염된 O. tsutsugamushi균의 유전형에 따라 항생제 치료를 진행했음에도 불구하고 균이 제거되지 못하고 마우스의 비장과 혈액에 남아있음을 확인하였으며, 이를 통해 충분하고도 신중한 항생제 치료의 중요성을 제시하였으며, 진단적 방법 및 사망 예측인자로써의 real-time PCR의 유용성을 확인하였음.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 3
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 4
• 2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 4
• 가. L929 mouse fibroblast cell culture model을 이용하여 다른 병원성을 가지는 O. tsutsugamushi 균주들의 배양 및 증식 ... 4
• 나. 감염된 L929 cells에서 O. tsutsugamushi 검출을 위해 Orientia-specific 56 kDa nested PCR, INNOPLEXTM TSUTSU detection kit (Intron)를 이용한 nested PCR 및 sequencing, 그리고 indirect immunofluorescence assay (IFA) 수행 ... 4
• 다. Plaque assay 및 In vitro cell culture model을 이용하여 다양한 항생제에 대한 O. tsutsugamushi in Vitro Susceptibilities 측정 ... 5
• 라. 다른 병원성을 가지는 O. tsutsugamushi 균주들을 lethal농도와 Sublethal 농도로 복강 주사 후 각 기관에서 Orientia infection 정도와 각 세포별 분포정도를 관찰 ... 6
• 마. 1차년도 연구를 통해 얻은 결과를 토대로 쯔쯔가무시병 중증 질환 마우스 모델에서 사망률을 줄일 수 있는 가장 효과적인 항생제를 알아보기 in Vivo Susceptibilities 측정 ... 6
• 3. 연구개발결과의 중요성 ... 8
• 4. 참고문헌 ... 9
• 5. 연구성과 ... 10
• 끝페이지 ... 10