[보고서]Cronobacter sakazakii와 Bacillus cereus를 선택적으로 공격하는 신규 박테리오파지(Bacteriophage)의 분리 및 산업적 이용 연구

윤성식

Cronobacter sakazakii와 Bacillus cereus를 선택적으로 공격하는 신규 박테리오파지(Bacteriophage)의 분리 및 산업적 이용 연구
Studies on the isolation and industrial utilization of novel bacteriophages to specifically infecting Cronobacter sakazakii and Bacillus cereus 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	연세대학교 Yonsei University
연구책임자	윤성식
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2018-11
과제시작연도	2017
주관부처	교육부 Ministry of Education
등록번호	TRKO201900026518
과제고유번호	1345270812
사업명	개인기초연구(교육부)
DB 구축일자	2020-09-05
키워드	박테리오파지/파지.크로노박터 사카자키.바실러스 세레우스.염기서열 분석.동결건조.파지 대량생산.주석.생물발표기.high titer lysate.annotation.jar fermentor.

초록 ▼

□ 연구개요
조제분유 및 기타 영·유아 식품에 빈번하게 오염되어 식중독을 야기하는 Cronobacter sakazakii와 Bacillus cereus를 선택적으로 공격하는 박테리오파지(이하, 파지로 명명)의 분리 및 동정을 실시함. 분리한 신규 파지 분리주의 분자생물학적 특성과 유전학적 연구 및 저장성과 안정성에 대한 분석, high titer 파지 용균액을 대량배양하기 위한 파지의 생산조건을 확립함으로써 조제분유와 같은 분체식품에서의 산업적 응용가능성을 검토하였음.

□ 연구 목표대비 연구결과
◎ 연구 목표
• C. sakazakii와 B. cereus에 특이적인 파지(주)의 탐색 및 분리
• 분리한 신규 파지의 배양 조건 및 high titer 파지 용균액 생산조건 검토
• 파지에 대한 유전적 특성 연구
• 파지의 formulation(재제화) 연구를 통한 보존성, 안정성 검토
• 파지의 대량생산 시스템 연구
• 조제분유 및 기타 영·유아 식품에 대한 산업적 이용성 연구
◎ 연구 결과
• 돼지분변에서 C. sakazakii에 특이적인 파지를 분리하였고, 지렁이 분변토에서 B. cereus에 특이적인 파지를 분리하여 형태학적 특성을 분석하였음.
• 다양한 온도와 pH에 노출함으로써 파지의 생육조건을 검토하였고, PEG 8000을 첨가한 파지 용균액을 초고속원심분리기를 이용하여 high titer 파지 용균액 생산조건을 확립하였음.
• 추출한 파지 genomic DNA를 전기영동한 결과, 파지 genomic DNA의 대략적인 크기를 확인 하였고, 제한효소 처리 후 파지 DNA 단편의 지문패턴(finger printe)를 분석하였음.
• 추출한 파지 genomic DNA의 염기서열분석을 실시하여, C. sakazakii 파지는 75개, B. cereus 파지는 243개의 ORF(open reading frame)를 탐색하였고, 그 기능을 annotation 하였음.
• 동결건조한 파지분말의 활성을 확인한 결과, 파지의 활성이 10주간 안정적으로 유지되는 것을 확인하였음.
• Jar fermenter bioreactor를 이용해 파지 분리주의 대량배양 조건을 확립하였음.
• C. sakazakii와 B. cereus에 오염시킨 조제분유에 파지를 접종한 실험결과, 파지 분리주는 병원성 세균을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였음.

□ 연구개발결과의 중요성
본 연구를 통하여 C. sakazakii와 B. cereus를 선택적으로 공격하는 파지의 숙주 특이성을 바탕으로 C. sakazakii와 B. cereus를 효과적으로 제어할 수 있는 생물학적 재제를 개발할 수 있는 잠재적 가능성을 확인하였음. 또한 영·유아의 식중독 예방 및 식품위생 수준을 향상시키고, 파지 유전자의 분석과 특성에 대한 연구를 수행함으로써 국내 학계에 파지공학(phage engineering)의 기반기술 확립에 기여하였음. 향후 파지 치료법, 파지디스플레이, 파지진단법과 같은 다양한 분야에서 파지를 이용한 생물학적 제어 기술을 적용할 수 있을 것으로 사료됨.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 3
2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 4
3. 연구개발결과의 중요성 ... 9
4. 참고문헌 ... 9
5. 연구성과 ... 9
끝페이지 ... 9

표/그림 (10)

표 Dotting assay and pour plate assay of bacteriophages active against C. sakazakii ɸCS01(A) and B. cereus ɸBC01(B). Medium : A: BHI(Brain Heart Infusion), B: TS(Tryptic Soy), Sample : 10㎕(Dotting assay) and 100㎕(Pour plate assay)
표 TEM images of C. sakazakii ɸCS01 (A) and B.cereus ɸBC01 (B) belong to the family Myoviridae. The phages were negatively stained with 2% (wt/vol) uranyl acetate and observed using TEM JEM-2100 (JEOL, Tokyo, Japan) at 200 kV
표 Agarose gel electrophoresis of restriction enzyme-digested phage DNA of ΦCS01(A) and Φ BC01(B). (A) M: 1kb ladder; lane 1: CS01 phage DNA; lane 2: EcoRⅠ; lane 3: EcoRⅤ; lane 4: HindⅢ; lane 5: BamHⅠ; lane 6: XhoⅠ; lane 7: SalⅠ; lane 8: KpnⅠ. (B) M: 1kb ladder; lane 1: ΦBC01 DNA; lane 2: EcoRⅠ; lane 3: EcoRⅤ; lane 4: BamHⅠ;　lane 5:　HindⅢ lane; 6: XhoⅠ lane 7: Sal Ⅰ
표 Gene map of the genome of C. sakazakii ФCS01 and B. cereus ФBC01
표 Growth conditions of ΦCS01 and ΦBC01. Temperature stability test of ΦCS01 and ΦBC01(A and B) ; pH stability test of ΦCS01 and ΦBC01(C and D)
표 Culture conditions of jar fermenter bioreactor
표 Overview of consecutive steps of the freeze-drying process
표 Stability test of bacteriophage high titer after lyophilization with pour plate assay. (A) PFU/ml of lyophilized ФCS01 sample. (B) PFU/ml of lyophilized ФBC01 sample
표 Inhibition of host-bacteria with C. sakazakii phage ФCS01 and B. cereus phage ФBC01 in medium. C. sakazakii Phage was added at the MOI of approximately 1 (blue), 10 (red), 100 (green) or 1000 (orange). Control (black) without phage in medium (A); B. cereus Phage was added at the MOI of approximately 10,000 (orange), 100,000 (gray), 1,000,000 (yellow) or 10,000,000 (blue) in medium. Control (black) without phage (B)
표 Inhibition of host-bacteria with C. sakazakii phage ФCS01 and B. cereus phage ФBC01 in reconstituted infant formula. C. sakazakii phage was added at the MOI of approximately 1 (blue), 10 (red), 100 (green) or 1000 (orange) in reconstituted infant formula. Control (black) without phage(A); B. cereus Phage was added at the MOI of approximately 1 (orange), 100 (red), 10,000 (yellow), 1,000,000 (blue) or 100,000,000 (green) in the reconstituted infant formula. Control (black) without phage(B)

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