[보고서]종양억제 유전자 NDRG2의 하위 표적으로서의 전사인자 발굴 연구 및 그 작용기전 연구

임종석

종양억제 유전자 NDRG2의 하위 표적으로서의 전사인자 발굴 연구 및 그 작용기전 연구
Identification and Functional Analysis of Transcription Factors as Downstream Signaling Molecules of Tumor Suppressor Gene NDRG2 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	숙명여자대학교
연구책임자	임종석
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2018-11
과제시작연도	2017
주관부처	교육부 Ministry of Education
등록번호	TRKO201900026667
과제고유번호	1345271360
사업명	개인기초연구(교육부)
DB 구축일자	2020-09-12
키워드	종양억제유전자.siRNA library 검색.전사인자.전이억제유전자.세포신호전달.NDRG2.

초록 ▼

□ 연구개요
삼중음성유방암 세포 및 양성 유방암세포주에서의 종양억제 유전자 NDRG2의 발현 차이를 활용한 siRNA library screening을 수행하여 얻어진 종양억제 유전자 하위 표적으로서의 전사인자의 기능연구 및 종양전이 억제에 신규 표적 활용 연구
- siRNA library screening 조건의 최적화; snail promotor 활성 측정 조건 최적화 및 genome-wide screen을 수행하기 전에 작은 규모에서의 pilot screening을 수행
- siRNA library screening 수행: 최적화된 조건에서 siRNA library screening 수행. Positive control siRNA와 negative control siRNA의 결과에 따라 library screening의 실효성 확인
- 스크리닝 데이터의 분석 및 발굴된 단백질들의 생물학적 기능 연구
- 발굴된 유전자와 NDRG2의 상호작용 연구
- NDRG2 유전자의 기능을 증강시키거나 억제시키는 기전 연구.
- 발굴된 유전자의 과발현이 암세포의 전이능력에 관련된 표현형, 즉 EMT 현상, 세포의 이동 및 침윤을 포함하는 암세포의 기능 억제에 미치는 영향을 확인

□ 연구 목표대비 연구결과
- Snail Reporter Gene의 활성검색을 이용한 siRNA Screening System의 구축
현재까지 NDRG2의 종양억제유전자 기능이 다양하게 알려지고 있으나, 그 구체적인 억제 기전에 대해서는 많이 밝혀져 있지 못함. 따라서 NDRG2의 구체적 작용기전 연구를 위해서 이유전자의 기능을 차단할 수 있는 검색기술을 활용한다면 새로운 표적의 발굴이 가능할 것으로 기대하였음. 본 연구에서는 본 연구팀이 확보한 NDRG2에 의한 Snail 발현 억제기능 확인 및 Snail 활성 검색기술을 기반으로 NDRG2 유전자의 억제기능 손실에서 확인되는 필수적인 하위 세포신호전달계 발굴을 위해서 전사인자 siRNA를 이용한 전사인자 표적 발굴 방법을 활용하고자 하였음.
- 종양억제 유전자 기능에 관여하는 신규 전사인자의 발굴 및 기능연구
1차년도의 연구에서 유방암 세포를 모델로 한 종양억제 유전자 NDRG2의 과발현에 의해서 억제된 Snail의 발현이 다양한 전사인자 siRNA library screening에 의해서 Snail 발현이 회복되는 정도를 확인하였음. 2차년도에는 이들 다양한 전사인자 중에서 C/EBPα에 의한 Snail의 발현 회복이 가장 크게 나타난 사실에 기초하여 NDRG2 발현과 C/EBPα 발현간의 상관관계와 기능적 관련성을 분석하고자 하였음.
- NDRG2와 상호작용하는 전사인자의 작용기전 확립
3차년도에는 C/EBPα 이외의 발굴된 유전자인 EHF와 FOXC1이 NDRG2 유전자와 상호작용하는지에 대해 다양한 분자생물학적 기법으로 검증하여 NDRG2 유전자에 대한 의존성을 확인하고자 하였음. 또한 이 유전자의 과발현 혹은 siRNA를 통한 발현의 억제가 전이능력에 관련된 표현형, 즉 EMT 현상과 세포의 이동 및 침윤을 포함하는 암세포의 기능 억제에 미치는 영향을 알아보고자 하였음.

□ 연구개발결과의 중요성
(1) 학문적 파급효과
- 새로운 종양억제유전자로서 NDRG2 유전자의 기능을 밝히고 이를 조절하는 인자들을 규명함으로써 종양, 특히 악성암의 진단 및 치료에 활용 가능한 표적을 제시할 수 있으며, 이러한 결과들을 유수의 국제 전문학술지에 게재하는 연구 성과를 기대할 수 있음.
(2) 기술적 파급효과
- NDRG2 유전자의 암전이억제 기능 제시
- 새로운 표적치료 접근법 모색
(3) 경제·산업적 파급효과
- 본 연구진이 제안하는 종양 억제기전은 난치성 질환 치료제 개발의 핵심을 이룰 수 있을 것으로 기대되어 궁극적으로 경제적 효과가 상당할 것으로 전망.
- 연구수행 과정을 통한 연구 인력 양성 효과 및 여성 일자리 창출

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 3
2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 4
3. 연구개발결과의 중요성 ... 9
4. 참고문헌 ... 10
5. 연구성과 ... 10
끝페이지 ... 11

표/그림 (12)

표 본 연구과제의 1-3년차 연구목표 및 내용
표 Effect of NDRG2 overexpression on the Snail promoter activity in MDA-MB-231 cells MDA-MB-231 cells stably transected with the empty vector (mock) or NDRG2 plasmid DNA. The mRNA and protein levels of NDRG2 in MDA-MB-231-wild type, -mock, -NDRG2 cells were analyzed by using (A) RT-PCR and (B) western blot analysis. (C) The mRNA level of Snail and E-cadherin in MDA-MB-231-mock and -NDRG2 cells was measured by real-time PCR using each gene specific primer. (D) MDA-MB-231-wild type, -mock, and -NDRG2 cells were transiently transfected with a Snail-Luc reporter plasmid using the Lipofectamine 3000 reagent for 24 h. The transfection efficiency was normalized by co-transfecting the cells with pCMV-β-galactosidase. After incubation for 24 h, the cells were harvested in passive lysis buffer, and the activities of luciferase were analyzed using the dual luciferase assay system with luminometer. The difference in the activity of luciferase with respect to the WT-control was calculated. **p < 0.01, and ***p < 0.001
표 Effect of C/EBPα knockdown on NDRG2-induced Snail down-regulation in NDRG2-overexpressing MDA-MB-231 cells. (A) The expression level of C/EBPα in MDA-MB-231-mock and MDA-MB-231-NDRG2 cells was confirmed by western blot analysis using C/EBPα specific antibodies. NDRG2-overexpressing MDA-MB-231 cells were transfected with control-siRNA, C/EBPα-siRNA, and NDRG2-siRNA using the DharmaFECT reagent for 24 h, and then the mRNA and protein level of cells was analyzed by using (B) western blot analysis and (C) real-time PCR
표 Effect of C/EBPα knockdown on NDRG2-induced Snail down-regulation in MCF7 cells. MCF7 cells were transfected with control-siRNA, C/EBPα-siRNA, and NDRG2-siRNA using the DharmaFECT reagent for 24 h, and then the mRNA and protein level of cells was analyzed by using (A) western blot analysis and (B) real-time PCR. (C) The siRNA-transfected cells were scratched with a pipette tip (0 h), and observed with phase-contrast microscopy (24 h and 48 h). The dotted lines represent the wound margin. The relative closed-wound distance (healing) was calculated after measuring the widths of at least four wounds
표 Overview of TCGA PAM50 dataset (*TN: triple negative breast cancer)
표 Analysis of NDRG2 and Snail gene expression using TCGA PAM50 dataset
표 Analysis of NDRG2 and C/EBPα gene expression using TCGA PAM50 dataset
표 Analysis of NDRG2 and EHF gene expression using TCGA PAM50 dataset
표 Expression and effect of EHF on cell growth in MDA-MB-231 cells. (A) The expression level of NDRG2 and EHF in MDA-MB-231 cells was measured by real-time PCR. (B) MDA-MB-231 cells were transiently transfected with pCMV-tag2B vector or NDRG2. After transfection, the mRNA level of NDRG2 and EHF was analyzed by using real-time PCR. (C) MDA-MB-231 cells were transiently transfected with pCMV-tag2B vector or EHF. After 24h of incubation, the cells were harvested and seeded in 96-well plate. Relative cell confluency was measured for 2 days by using IncucyteⓇ
표 Analysis of EHF and Snail gene expression using TCGA PAM50 dataset
표 Analysis of FOXC1 and Snail gene expression using TCGA PAM50 dataset
표 Expression of NDRG2 and FOXC1 in MDA-MB-231 cells The expression level of NDRG2 and FOXC1 in MDA-MB-231 cells was measured by real-time PCR

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과제기간(DetailSeriesProject) :	-
총연구비 (DetailSeriesProject) :	-
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