[보고서]아르기닌 메틸화 조절 기전 기반 심부전 제어 연구

정명호

아르기닌 메틸화 조절 기전 기반 심부전 제어 연구
The study for regulatory mechanisms of heart failure by protein arginine methylation 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	성균관대학교 SungKyunKwan University
연구책임자	정명호
참여연구자	이혜영
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2019-06
과제시작연도	2019
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
등록번호	TRKO202000002447
과제고유번호	1345293947
사업명	개인기초연구(교육부)(R&D)
DB 구축일자	2020-07-29
키워드	PRMT1.PRMT7.Cardiomyopathy.Cardiac hypertrophy.Cardiac fibrosis.Arginine methylation.ATF4.Wnt/beta-catenin.

초록 ▼

연구개요
Prmt1 또는 Prmt7의 결손에 의한 확장성 심근병증 및 심근 섬유화의 유도기전을 규명하고 질병 예방 및 증상완화를 위한 새로운 메커니즘을 발굴한다. 이를 위하여, 본 연구에서는 아르기닌 메틸화 효소의 결손관련 심장표현형을 심층 분석하며, 아르기닌 메틸화효소들의 상호작용분석, 및 심부전모델이용 이들 효소들의 기능규명 및 하부 타겟인자 발굴이라는 세부목표를 통하여, 궁극적으로, 확장성 심근 병증 및 심근 섬유화, 및 심부전에서 아르기닌 메틸화효소 기전 및 발굴된 타겟을 이용하여 심근 병증 및 심부전 예방과 치료에 기여할 새로운 전략을 모색하고자 함.

연구 목표대비 연구결과
1. 아르기닌 메틸화 효소 활성에 의한 심장/심근 세포주 표현형 분석 - (1) 심근 특이적 Prmt1, Prmt7 결손 생쥐의 심장을 사용하여 H&E 염색 과 Sirius Red 염색을 실시하여 표현형을 분석함. 그 결과 Prmt1과 Prmt7 결손 심장에서 심근 비대 및 심근 섬유화가 대조군에 비해 증가되어 있음을 확인함. (2)Newborn rat ventricular cardiomyocyte (NRVM)에 Prmt1 및 7을 knockdown하면 세포의 표면적이 증가하며, 심근 비대 및 심근 섬유화와 관련되는 유전자들의 발현이 증가됨을 알 수 있음.
2. 아르기닌 메틸화효소들의 상호작용 분석 - (1) Prmt1의 경우 ATF4의 메틸화를 통해 ATF4의 단백질 분해과정을 촉진하여 ATF4에 의해 유도되는 심부전 및 심근세포 사멸과정을 제어하는 것으로 나타남. (2) Prmt7의 경우 b-catenin의 단백질 분해과정을 촉진하여 심근 섬유화 및 심근비대증을 억제 할 수 있는 것으로 나타남.
3. 심부전 모델 이용 아르기닌 메틸화 효소들의 기능 규명 - Prmt1 및 7의 결손이 생쥐 심장의 심부전을 유도하는 것으로 나타남. 또한 심부전 환자의 샘플에서 Prmt1의 발현이 감소되어 있는 것을 확인함. 따라서 Prmt1 및 7의 발현이 심부전 예방 및 치료에 중요할 것이라 사료됨.

연구개발결과의 중요성
본 연구를 통하여 규명될 심근 비대/섬유화 조절 기전을 활용하여 유전적, 환경적 요인에 의한 심근 기능상실의 새로운 예방법 및 치료물질 단서와 아이디어 제공. 심근비대/섬유화 관련 단백질의 발현/활성 조절 메커니즘을 제공함으로써, 심기능 저하에 관련한 새로운 치료기반 제공. 아르기닌 메틸화 조절을 통한 심기능 강화/회복 전략 제공. 가족성 심부전증을 일으키는 주요 단백질에 대한 새로운 치료법 개발.

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1연구결과 요약문 ... 2목차 ... 31. 연구개발과제의 개요 ... 3 가. 아르기닌 메틸화 ... 3 나. 심근비대 및 심근 섬유화 ... 3 다. 스트레스 기전조절 ... 42. 연구수행내용 및 연구결과 ... 4 가. PRMT7 결손 심장/심근세포주 표현형 심층 분석 ... 4 나. PRMT7 활성에 의한 심근세포주 분자 신호 기전 분석 ... 5 다. PRMT7 결손 심장/심근 세포주 활용 하부 타겟 분자 발굴 ... 5 라. PRMT1 결손 심장의 표현형 심층분석 ... 7 마. PRMT1 활성 억제를 통한 심근세포주의 ER-stress 기전 분석 ... 7 바. PRMT1에 의한 ER stress 기전조절의 타겟 발굴 ... 83. 연구개발결과의 중요성 ... 94. 참고문헌 ... 105. 연구성과 ... 12끝페이지 ... 12

표/그림 (16)

표 단백질 아르기닌 메틸화 기전 개요
표 심장 근육 질병 종류 및 증상
표 스트레스 자극에 의한 stress granule 생성 기전
$PRMT7이 특이적으로 결손된 심장의 기능을 분석함. (A-B) 12주령의 수컷 PRMT7 WT (PRMT7f/f)와 PRMT7 null (PRMT7 cKO) 생쥐의 심장 기능을 분석함. 그 결과 심장의 기능을 나타내는 EF (Ejection fraction, 구출분획력)과 FS (Fractional shortening, 구획단축률)이 PRMT7이 결손된 심장에서 유의적으로 감소하는 것을 확인함. (B) 또한 심장 비대를 나타내는 LV mass (Left ventricle mass, 좌심실량) 또한 유의적으로 증가해 있음을 확인하였음.(C-D) 뿐만 아니라, 심장 절편을 사용하여 심근심유화 및 심근 비대를 측정함. 그 결과 심근 섬유화 및 심근 비대가 대조군 생쥐에 비교하여 유의적으로 증가되어 있음을 확인함. 이는 PRMT7의 결손이 심근 비대 및 심근 섬유화를 유도 할 수 있음을 나타냄$ 표 PRMT7이 특이적으로 결손된 심장의 기능을 분석함. (A-B) 12주령의 수컷 PRMT7 WT (PRMT7f/f)와 PRMT7 null (PRMT7 cKO) 생쥐의 심장 기능을 분석함. 그 결과 심장의 기능을 나타내는 EF (Ejection fraction, 구출분획력)과 FS (Fractional shortening, 구획단축률)이 PRMT7이 결손된 심장에서 유의적으로 감소하는 것을 확인함. (B) 또한 심장 비대를 나타내는 LV mass (Left ventricle mass, 좌심실량) 또한 유의적으로 증가해 있음을 확인하였음.(C-D) 뿐만 아니라, 심장 절편을 사용하여 심근심유화 및 심근 비대를 측정함. 그 결과 심근 섬유화 및 심근 비대가 대조군 생쥐에 비교하여 유의적으로 증가되어 있음을 확인함. 이는 PRMT7의 결손이 심근 비대 및 심근 섬유화를 유도 할 수 있음을 나타냄
표 PRMT7이 결손된 심근세포 (NRVM, New born Rat ventricular cardiomyocyte) 의 표현형을 분석함. (A-C) shRNA-PRMT7을 사용하여 NRVM cell의 PRMT7을 결핍시킨 경우 NRVM의 세포 표면적이 증가되어 있는 것을 확인함. (D) 또한 patch clamp를 사용하여 세포의 capacitance (전기용량)을 분석한 결과, PRMT7이 결핍된 NRVM에서 cellular capacitance가 증가되어 있음을 확인함. (E) 또한 심근 세포 비대의 marker로 알려진 ANP, BNP, b-MHC 의 발현이 PRMT7이 결핍된 NRVM cell에서 유의적으로 증가되어 있음을 확인함. (F-G) 뿐만아니라 PRMT7이 과발현 된 NRVM 의 경우, cellular area가 세포 비대 유도약물인 PE(phenylephrine)의 처리에도 증가하지 않는 것을 확인함. (H-I) qRT-PCR을 통하여 ANP, BNP, b-mhc의 발현이 유의적으로 감소하는 것을 확인함 이는 PRMT7이 세포비대를 억제하는 중요한 역할을 할수 있음을 나타냄
표 PRMT7이 결손된 심장의 단백질 발현 분석. PRMT7이 결손된 심장 (PRMT7-/-, PRMT7 cKO) 의 단백질 발현을 분석함, 심근 비대 및 심근 섬유화가 진행될 시, 발현이 증가하는 Col1, ANP, a-SMA b-catenin 의 발현이 대조군 생쥐에 비해 PRMT7이 결손된 심장에서 높게 발현되는 것을 확인함. 이는 PRMT7이 결손될 경우 심근 비대 및, 심근 섬유화의 진행이 증가되는 것을 나타냄
표 Wnt/beta-catenin 신호전달 기전을 PRMT7이 억제할 수 있음. (A) PRMT7이 과발현된 10T1/2 세포의 beta-catenin reporter activity (Top-flash luciferase activity)가 유의적으로 감소하는 것을 확인함. (B)또한 PRMT7이 과발현된 경우 Wnt 타겟 유전자인 Axin2의 발현이 유의적으로 감소되는 것을 확인함.(C-D) 면역 염색법을 통하여 PRMT7이 과발현된 NRVM 세포의 핵내 b-catenin의 발현을 확인함. 그 결과 핵 내에 존재하는 b-catenin의 발현양이 PRMT7이 과발현 된 세포 (red)에서 유의적으로 감소하는것을 확인함. (E) 또한 western blot을 통하여 PRMT7이 과발현된 세포에서 b-catenine의 활성도 감소하는 것을 확인함. 이는 PRMT7이 b-catenin의 활성을 조절하여 Wnt 시그널링을 조절 할 수 있음을 나타냄
표 b-catenin의 활성이 대칭적 아르기닌 메틸화 (symmetric arginine di-methylation)에 의해 조절됨을 확인함. (A-B) PRMT7과 b-catenin이 complex를 형성함을 IP를 통해 HEK293T 세포와 mouse 심장 조직에서 확인함. (C-F) b-catenin에서 대칭적 아르기닌 메틸화가 일어나며 이것이 PRMT7 특이적 활성 억제제인 DS-437에 의해 감소되는 것을 HEK293T 세포와 NRVM 세포에서 확인함. (G-H) PRMT7이 결손된 심장에서 b-catenin의 대칭적 아르기닌 메틸화가 감소되어 있으며 b-catenin의 발현이 증가되어 있는 것을 확인함. (I) 심부전 환자의 샘플에서 PRMT7이 감소되어 있는 경우 (2,3,4,5번) b-catenin의 발현이 증가되어 있으며 이때 심근비대증의 마커로 사용되는 Hdac2의 발현도 증가되어 있음을 확인함
표 PRMT7이 b-catenin의 ubiquitination을 증가 시킴. (A-B) HEK293T 세포주를 사용하여 PRMT7을 과 발현 시킨 경우 b-catenin의 분해가 contol cell에 비교하여 빨라지는 것을 확인함. (C) 또한 유비퀴틴-프로테아좀 기전 억제제인 MG132를 처리하여 확인한 결과 PRMT7이 과발현된 세포에서 b-catenin의 유비퀴틴화가 증가됨을 확인함
표 PRMT7에 의한 b-catenin의 R93잔기의 메틸화가 b-catenin의 분해를 촉진시킴. (A) LC-MS/MS 분석결과 b-catenin의 R93과 R591의 대칭적 아르기닌 메틸화가 일어남을 확인함. (B-D) b-catenin의 R93A 돌연변이의 경우 대칭적 아르기닌 메틸화가 WT대비 40%로 감소되어 있고 Top-flash luciferase activity 가 유의성 있게 증가됨을 확인함. (E) PRMT7의 methyltransferase 기능을 억제하는 Adox를 처리한 결과 PRMT7에 의해 증가되는 b-catenin의 유비퀴틴화가 다시 감소되는 것을 확인함.(E) b-catenin R93A 돌연변이의 경우 PRMT7의 과발현으로 인해 일어나는 b-catenin의 분해 촉진 과정이 억제되어 있음을 확인함
표 PRMT1이 결손된 생쥐의 심장에서 ER stress 와 연관된 신호가 증가되어 있음을 확인함. (A-B) 2주령 생쥐의 심장의 유전자 발현을 RNA-sequencing을 통해 분석한 결과 PRMT1 이 결손된 심장의 유전자 발현이 ER stress inducer로 알려진 Tunicamycine(TN)이 주입된 생쥐의 유전자 발현과 매우 유사함을 확인함. (C-D) PRMT1이 결손된 심장의 심근세포가 WT 대비 5~7%가량 증가되어 있음을 확인함. 특히 PRMT1이 결손된 심장의 심근세포 사멸이 TN이 주입되었을 때 더욱 증가되는 것을 확인함. (E) PRMT1이 결손된 심장에서 ER stress marker로 알려진 ATF4/CHOP의 발현이 증가해 있음을 확인함. 역시 TN이 주입되었을 때 ATF4와 CHOP의 발현이 더욱 증가되는 것을 확인함
표 PRMT1 활성억제로 인해 ER stress signaling이 활성화됨. (A-C) PRMT1 inhibitor인 Furamidine이 처리된 NRVM cell에서 ATF4/CHOP의 발현이 증가하는 것을 immuno staining과 westernblot을 통해 확인함. (D) ER stress 활성을 측정하기위해 ERSE 및 ATF4 luciferase activity를 확인한 결과 Furamidine이 처리된 H9C2 cell에서 ER stress 활성이 증가하는 것으로 나타남. TN은 positive control로 사용됨
표 PRMT1의 과발현이 TN이 처리된 심근세포의 ER stress를 감소시킴. (A-B) NRVM cell에 TN을 처리하여 CHOP의 발현을 확인함. PRMT1이 과발현 된 세포의 경우 TN 이 처리되었을 때 CHOP의 발현이 유의성있게 감소된 것을 확인함. (C) PRMT1이 과발현된 NRVM cell의 TN 처리 후 ER stress response를 확인함. ATF4와 CHOP의 발현이 감소하고 cell death marker인 c-Caspase3의 발현이 감소된 것을 확인함. (D) ER stress marker의 발현을 qRT-PCR을 통해 확인함. ATF4, ATF3, CHOP, BiP, GRP94, Xbp1s의 발현이 PRMT1이 과발현 되었을 때 TN 처리 시 감소되는 것을 확인함. (E) 마찬가지로 위 조건에서 cell death marker인 p-γH2AX의 발현을 확인함. (F) TN이 처리된 H9C2의 ERSE luciferase 활성이 PRMT1이 과발현 되었을 때 감소되는 것을 확인함
표 PRMT1의 억제에 의해 발생되는 ER stress response가 ATF4의 knockdown에 의해 회복됨. (A-B) Furamidine 처리에 의한 ER stress markergene의 발현이 ATF4의 knockdown에 의해 회복 되는 것을 qRT-PCR과 Western blot을 통해 확인함. (C-D) Control siRNA가 도입된 H9C2 cell의 경우 Furamidine의 처리에 의해서 ATF4/CHOP의 발현이 증가되는 것을 보이지만 siATF가 도입된 cell의 경우 ATF4/CHOP의 발현이 control cell 수준으로 감소되는 것을 확인함
표 PRMT1이 ATF4와 결합함 (A) Immunoprecipitation을 통하여 ATF4와 PRMT1이 서로 결합함을 확인함. (B) ATF4의 대칭성 메틸화가 PRMT1의 억제에 의해 감소되는 것을 확인함. (C-D) ATF4의 아르기닌 잔기 중 R239, R244, R257, R294이 메틸화 될수 있음을 확인함. 각 잔기의 아르기닌을 라이신(K)로 만든 경우 R239K ATF4의 경우 대칭성 메틸화가 감소되는 것을 확인함. R244의 경우 human ATF4에만 있는 것으로 확인됨
표 ATF4의 R239의 메틸화 기전이 ATF4의 단백질 안전성을 조절할 수 있음. (A-B) ATF4의 R239K mutant의 경우 단백질의 반감기가 WT에 비하여 유의적으로 증가됨을 확인함. (C) ATF4의 ubiquitination이 PRMT1 inhibitor인 Furamidine에 의해 감소됨을 확인함. (D) ATF4 R239K mutant의 경우 PRMT1의 과발현에 의한 단백질 분해 촉진 과정이 나타자지 않음을 확인함

과제명(ProjectTitle) :	-
연구책임자(Manager) :	-
과제기간(DetailSeriesProject) :	-
총연구비 (DetailSeriesProject) :	-
키워드(keyword) :	-
과제수행기간(LeadAgency) :	-
연구목표(Goal) :	-
연구내용(Abstract) :	-
기대효과(Effect) :	-

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 제목(한글), 저자명(한글), 발행일자, 전자원문, 초록(한글), 초록(영문) 관리번호, 제목(한글), 제목(영문), 저자명(한글), 저자명(영문), 주관연구기관(한글), 주관연구기관(영문), 발행일자, 총페이지수, 주관부처명, 과제시작일, 보고서번호, 과제종료일, 주제분류, 키워드(한글), 전자원문, 키워드(영문), 입수제어번호, 초록(한글), 초록(영문), 목차
저장형식	Text(ASCII format) Excel format
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증

아르기닌 메틸화 조절 기전 기반 심부전 제어 연구
The study for regulatory mechanisms of heart failure by protein arginine methylation 원문보기

초록 ▼

목차 Contents

표/그림 (16)

표/그림 (16)

참고문헌 (25)

연구과제 타임라인

관련 콘텐츠

원문 보기

이 보고서와 함께 이용한 콘텐츠

AI-Helper ※ AI-Helper는 오픈소스 모델을 사용합니다.

선택된 텍스트

연합인증

아르기닌 메틸화 조절 기전 기반 심부전 제어 연구 The study for regulatory mechanisms of heart failure by protein arginine methylation 원문보기

초록 ▼

목차 Contents

표/그림 (16) 모든 표/그림 보기

표/그림 (16) 슬라이드로 보기

참고문헌 (25)

연구과제 타임라인

전체(0) 논문(0) 특허(0) 보고서(0)

전체(0) 논문(0) 특허(0) 보고서(0)

관련 콘텐츠

원문 보기

이 보고서와 함께 이용한 콘텐츠

AI-Helper ※ AI-Helper는 오픈소스 모델을 사용합니다.

선택된 텍스트

아르기닌 메틸화 조절 기전 기반 심부전 제어 연구
The study for regulatory mechanisms of heart failure by protein arginine methylation 원문보기

표/그림 (16)

표/그림 (16)