초록 ▼

□ 연구개요
최종 목표: 효율적인 바이오매스 분해를 목적으로 초고온성 세균 Fervidobacterium islandicum AW1의 대사공학적 연구를 위한 유전공학적 기법(셔틀벡터, 유전자 disruption 및 발현법) 개발
○ 균주 형질전환에 가장 큰 장애물 중 하나는 외래 DNA의 도입시 methylation의 차이를 인식해서 균주 내부의 restriction system에 의해 도입된 DNA를 분해임
○ 제한 효소에 의한 형질전환 방해를 막는 방법으로는 여러 가지가 있는데 첫번째는 random mutat

□ 연구개요
최종 목표: 효율적인 바이오매스 분해를 목적으로 초고온성 세균 Fervidobacterium islandicum AW1의 대사공학적 연구를 위한 유전공학적 기법(셔틀벡터, 유전자 disruption 및 발현법) 개발
○ 균주 형질전환에 가장 큰 장애물 중 하나는 외래 DNA의 도입시 methylation의 차이를 인식해서 균주 내부의 restriction system에 의해 도입된 DNA를 분해임
○ 제한 효소에 의한 형질전환 방해를 막는 방법으로는 여러 가지가 있는데 첫번째는 random mutation이나 mutagen을 이용하여 특정 제한효소 유전자를 deletion 시키는 방법이고 두번째는 AW1의 methyltransferase를 대장균 등에서 이종발현하여 형질전환하기 직전에 DNA메틸화시키는 방법이며 세 번째는 상업적인 methyl transfersase들을 이용해서 DNA를 메틸화시키는 방법, 그리고 마지막으로 Dam 이나 Dcm 혹은 Type4 R-M system (certain Methylation pattern 을 인식해서 그 dna 를 분해하는 효소) 가 존재하다면, 다양한 E.coli methyltransferase mutant (dcm- 혹은 dcm-/dam-) 들을 이용하는 방법도 고려하여 실험
○ 효과적인 바이오매스의 분해: 현재까지 탄수화물 바이오매스의 분해에 가장 효과적인 미생물은 Caldicellulosiruptor bescii이고 난분해성 케라틴 분해 미생물은 Fervidobacterium 속의 세균들임. 본 과제는 Fervidobacterium 에서 기능하는 유전공학적 기술을 개발하여 탄수화물과 단백질을 동시에 분해할 수 있는 대사공학적 방법을 고안함으로써 새로운 바이오매스 분해에 도전하려고 함

□ 연구 목표대비 연구결과
1) 형질전환에 용이한 host development를 위한 restriction-modification system 분석: Fervidobacterium islandicum AW1 의 유전체 분석을 통해 밝혀진 type II nuclease인 fisI을 클로닝 및 이종발현하여 그 효소를 정제 및 characterization 하였음. 이를 통해 AW1 균주내의 제한효소 시스템 분석을 완료 하였음. 추후 이 제한효소 유전자를 CRISP cas9 기술을 이용해 deletion 하거나 도입하는 DNA에 시퀀스를 지우거나 메틸화하여 벡터개발을 자체적으로 완료 할 계획임
2) Mutant selection에 필요한 selection marker의 선정: 효과적인 대사공학 연구를 위해서 가장 중요한 것이 mutant selection을 쉽게 하는 것인데 antibiotics를 이용하는 것과 특정 대사 유전자를 결손시킨 후 complementation 시키는 nutritional selection 두 가지 방법으로 진행하여, 최종적으로는 pET28 시리즈의 벡터와 유사하게 구축하였음
3) 대장균과 Fervidobacterium isladicum AW1에서 복제 가능한 셔틀벡터의 구축: 기존 C. bescii 용 셔틀 벡터(pDCW89)와 내열성 kanamycin 유전자 포함된 pIKM1을 참고해 두가지 selection 방법에 맞게 대장균-Fervidobacterium 셔틀 벡터 구축함
4) 효율적인 transformation 방법 확립: Fervidobacterium isladicum AW1의 growth curve로부터 competent cell을 만들기 위한 최적 조건 확립 및 표준화 예정
5) 단백질 발현을 위한 효과적인 promoter의 선정: Fervidobacterium isladicum AW1의 qPCR 데이터 기반으로 가장 일정하게 발현 되는 constitutive gene의 프로모터와 inducible 프로모터 선정(T7 프로모터 구축)

□ 연구개발결과의 중요성
○ 국내 극한미생물 분야 신규연구인력 양성으로 극한미생물연구 활성화 및 저변확대
○ Fervidobacterium isladicum AW1을 그램 음성 고온세균 대사공학 모델 균주 발전
○ 대사공학 이외에도 바이오에너지 및 폐기물 처리 등 다양한 분야의 연구재료 제공
○ 단백질 및 탄수화물 바이오매스의 분해 및 재처리 기술 증대, 바이오매스 원료 고부가가치 산물 생산을 위한 독자적인 국내 원천기술 확보, 농축산 폐기물 처리, 음식물 쓰레기 처리 등 친환경 산업 발전, 바이오매스를 이용하는 화학 및 에너지 산업에 기여, 참여한 연구원들에게 취업 기회 부여하여 산학연 모델 창조
○ 필요한 바이오기업이나 정부출연연구기관에 기술이전

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 3
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 3
• 2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 7
• [1] 1차년도 연구수행 내용 및 연구결과 ... 7
• [2] 2차년도 연구수행 내용 및 연구결과 ... 11
• [3] 3, 4차년도 연구수행 내용 및 연구결과 ... 13
• 3. 연구개발결과의 중요성 ... 14
• 4. 참고문헌 ... 15
• 5. 연구성과 ... 16
• 끝페이지 ... 19