[보고서]신장 FXR의 번역 후 기능과 신규 표적유전자 탐색

김동현

[국가R&D연구보고서] 신장 FXR의 번역 후 기능과 신규 표적유전자 탐색
Functional roles of post-translational modifications of kidney FXR and investigation of novel target genes 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	전남대학교 Chonnam National University
연구책임자	김동현
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2020-03
과제시작연도	2019
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
연구관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO202000004026
과제고유번호	1711086125
사업명	개인기초연구(과기정통부)(R&D)
DB 구축일자	2020-07-29
키워드	신장.핵수용체.번역후 변형.염증질환.크로마틴 어세이.

초록 ▼

□ 연구개요
신장질환에서 핵 수용체 FXR (Farnesoid X Receptor)을 이용하여 <신장 FXR의 번역 후 변형 기능과 신규 표적 유전자 탐색>이라는 주제로 연구과제를 수행하여 FXR을 통한 신장질환의 약물학적 치료 방안 및 신규 표적 유전자를 발굴하고 표적 유전자의 발현 조절 메커니즘에 대해 수행하는 것이 목표임. 체적인 세부목표는 다음과 같음. 1) 신장에서 핵 수용체 FXR의 번역 후 변형 탐색 및 기능적 역할 규명, 2) Global ChIP/RNA-sequence를 통한 FXR의 신규 표적 유전자 발굴 및 기능 연구

□ 연구 목표대비 연구결과
∘ 신장 질환모델에서 FXR의 번역 후 변형 탐색
- Kidney proximal tubule cell을 이용하여 FXR의 phosphorylation 및 Acetylation 확인 및 mutant를 이용한 유전자 변화 연구.
- 만성신장질환 모델인 UUO (unilateral ureteral obstruction) model mice에서 FXR의 phosphorylation level 연구.
- 고지방 사료를 통한 비만쥐에서 FXR agonist의 효과 및 PTMs확인
∘ 신장에서 FXR의 novel target gene 탐색 조건 확립
- 만성 신장질환 모델에서 FXR의 agonis에 의한 anti-fibrotic effect확인함.
- In vitro에서 anti-fibrotic effect를 위한 FXR agonist들의 조건확립
- NGS를 위한 FXR agonist 처리 조건 확립.
∘ 신장에서 FXR의 novel target gene 탐색
- Cellular signaling pathway에서 FXR-Src-YAP의 pathway를 규명.
- FXR의 agonist에 의한 Hippo pathway YAP의 phosphorylation 조절.
- ChIP assay 조건 확립 및 연구.
∘ 신장에서 FXR의 novel target gene 발굴
- RNA-Sequencing을 통한 신장 FXR target 유전자 지도 작성

□ 연구개발결과의 중요성
(1) FXR의 신호 전달 및 유전자 발현 조절 메커니즘 규명
1) 신장에서의 새로운 FXR의 번역 후 변형에 대한 연구 제시
2) 신장질환에서의 기능적 역할을 제시하여 약물학적인 치료 방안 제시
3) FXR의 상위 신호 전달 메커니즘 규명 및 유전자 발현 조절 기전 확보
(2) FXR의 신규 표적 유전자 지도 작성
1) 기존의 표적 유전자뿐 아니라 신장질환을 유도하는 신규 표적 유전자 제시.
2) 의료관련산업 분야: 신약개발, 유전병에 관한 의학적 응용 가능.
3) 표적 유전자의 발현 조절에 관한 신약 개발 사업 확대.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 6
가. 1차년도 개발 목표 및 결과 ... 6
나. 2차년도 개발 목표 및 결과 ... 8
다. 3차년도 개발 목표 및 결과 ... 10
3. 연구개발결과의 중요성 ... 12
4. 참고문헌 ... 14
5. 연구성과 ... 15
대표적 연구실적 ... 17
끝페이지 ... 22

표/그림 (12)

표 Post-translational modifications of FXR in cells and UUO mice models. (A) Effects of bile acids on endogenous FXR phosphorylation. (B) Acetylatio of FXR in HK2 cells. (C) Phosphorylation of FXR in control and UUO mice models
표 FXR activation suppresses fibrosis in HK2 cells. (A) HK2 cells were exposed to TGFbeta or GW4064. Expression of fibrotic markers (fibronectin, E-Cadherin, N-Cadherin, CTGF, and alpha-SMA) was analyzed by western blotting. (B) HK2 cells were exposed to TGFbeta and FXR agonists dose-dependent manner (GW4064 and CDCA). Expression of fibrotic markers was analyzed by western blotting
표 FXR agonist GW4064 controls YAP phosphorylation and its target genes in HK2 cells. (A) HK2 cells were exposed to TGFβ and GW4064. Phosphorylation of Src kinase and YAP were detected by western blotting. (B) GW4064 was treated with HK2 cells in a time-dependent manner and phosphorylation level of YAP signaling was analyzed by western blotting. (C) HK2 cells were treated with GW4064, and mRNA level of YAP target genes were detected by qRT-PCR
표 FXR agonist GW4064 increased an interaction of YAP upstream signal proteins. Vehicle or GW4064 was treated with HK2 cells. CoIP: (A) Sav1 was immunoprecipitated with Sav1 antibody, and Mst1 in the immunoprecipitation was detected by Mst1 antibody. (B) Mst1 was immunoprecipitated with Mst1 antibody, and Lats1 in the immunoprecipitation was detected by Lats1 antibody
표 Effects of FXR agonists in mouse kidney and HK2 cells (A) Adult male wild-type C57BL/6 mice 8 weeks of age were fed with normal or high fat diet for 12 weeks, and fed the 0.5 % OCA diet for 1 weeks. Collected mouse kidney were detected the mRNA levels by qRT-PCR. (B) WT FXR and acetylation mutant (K217Q or K217R) were transfected to HK2 cells. HK2 cells were treated with 250 mM GW4064 for 7 hours. mRNA levels of Shp and Srebp1c were detected by qRT-PCR
표 FXR agonist GW4064 treatment activates Hippo pathway. (A) HK2 cells were transfected with flag-FXR expression plasmid, and then, the cells were treated with 200 nM GW4064 for 30 min. Flag-FXR interaction with Src was detected by Co-IP/IB (B) Cells were treated with GW4064 (200 nM) for 30 min, and p-Src levels were determined by immunoprecipitation/immunoblot
표 ChIP assay by treatment with FXR agonist GW4064 in HK2 cells. HK2 cells were treated with GW4064 for indicated time, and then ChIP assay was performed. Enrichment relative to input levels were detected by q-PCR
표 Effects of FXR agonist GW4064 treatment in mouse liver and kidney. Adult male wild-type C57BL/6 mice 10 weeks of age were fasting for 10 hours, and then FXR agonist GW4064 (75 mg/kg) were treated by oral gavage. mRNA levels were detected by qRT-PCR
표 FXR ligands regulates autophagy protein in HK2 cells. (A) HK2 cells were treated with FXR ligands, GW4064, CDCA, and INT-747, for 1h, and then treaed with TGFβ (10 ng/ml) for 24h. Protein levels of αSMA, CTGF, p62, Beclin1, LC3, and Actin were detected by immunoblot. (B) Each protein/Actin levels in the vehicle-treated sample were set as 1. Relative levels are shown (n=3)
표 FXR agonist GW4064 treatment activates Hippo pathway. (A) HK2 cells were transfected with flag-FXR expression plasmid, and then, the cells were treated with 200 nM GW4064 for 30 min. Flag-FXR interaction with Src was detected by co-immunoprecipitation/immunoblot. (B-E) Cells were treated with GW4064 (200 nM) for 30 min, and p-Src levels were determined by immunoprecipitation/immunoblot (B). Mst1 interaction with Sav1 (C) or Lats1 (D) was detected by co-immunoprecipitation. (E) Src interaction with YAP was detected by co-immunoprecipitation. (F) Cells were treated with vehicle, GW4064 (GW, 200 nM), or PP2 (5 μM) for 30 min, and then, p-Tyr-YAP was detected by immunoprecipitation/immunoblot. Protein levels in input samples were detected by immunoblot
표 The loss of FXR increases fibrotic and YAP target gene expression in sham and UUO models. The left ureter of male wild-type(WT) and FXR knockout (FXR KO) mice was ligated for 7 days. Mice were euthanized 7 days after sham surgery (n=8) or UUO (n=8). (A) Paraffin–embedded kidney tissue sections from sham or UUO mice were stained with αSMA, F4/80, TGFβ, and ColIV antibodies (scale bar 100 μm). Computer-based morphometric analysis of kidney fibrosis in the UUO model (Right bar graph, n =10 in each group). (B) Protein levels of αSMA, CTGF, and FXR were detected by immunoblot. (C) Relative protein levels were shown. The values for WT-Sham group are set to 1. (D) The mRNA levels of indicated genes were measured by qRT-PCR. All values are presented as mean ± SD. (n =8 in each group). Statistical significance was measured using the one-way ANOVA with the Fisher least significant difference post-test. *P<0.05, **P<0.005 and NS, statistically not significant
표 RNA-Sequencing data analysis of Wild-type and FXR KO mouse kidney. Vehicle or FXR agonist GW4064 (35 mg/kg) treated with IP injcetion in wild-type and FXR KO mouse for 6h. RNA was purified with whole kidney, and RNA-Sequencing was performed

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