[보고서]효율적인 전분화능 줄기세포 (PSCs)의 배양기술개발

최한석

보고서 정보

주관연구기관

울산대학교
University of Ulsan

연구책임자

최한석

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2019-01

주관부처

과학기술정보통신부
Ministry of Science and ICT

등록번호

TRKO202000006491

DB 구축일자

2020-07-29

키워드

전분화능 줄기세포.코팅제/배양액.자생력확보.저분자 물질.질병모델연구.Pluripotent stem cell.Coating material/Medium.Self-surviva.Small molecules.Disease model study.

표 연구 개발의 개요
표 Homemade E8 medium의 조성
표 Homemade E8 medium에서 배양한 인간 배아줄기세포 H9(WA09) hESCs의 morphology
표 인간 배아줄기세포 H9(WA09) hESCs를 homemade E8 배지에서 10회 계대배양후 Oct4, Nanog antibody를 사용하여 immunofluorescence analysis를 진행함. Alkaline Phosphatase staining에서 양성반응을 보임. Scale bar=100 μm
표 Homemade E8 medium에서 배양한 인간 배아줄기세포 H9(WA09) hESCs의 FACS analysis. 만능성 마커인 SSEA4를 사용하여 98.4%의 H9(WA09) hESCs가 양성반응 (positive staining)을 보임
표 인간 배아줄기세포 H9(WA09)를 homemade E8 medium에서 10회 계대배양 후 karyotyping analysis를 진행함
표 인간 배아줄기세포 H9(WA09)를 DJ1 단백질을 포함한 homemade E8 basal medium에서 10회 계대 배양후의 morphology
표 인간 배아줄기세포 H9(WA09)를 DJ1 단백질을 포함한 homemade E8 basal medium에서 10회 계대 배양후 karyotyping analysis를 진행함
표 FGF2 또는 DJ1을 포함하는 homemade E8 basal medium으로 배양한 인간 배아줄기세포 H9(WA09) hESCs의 proliferation assay
표 FGF2 또는 DJ1을 포함하는 homemade E8 basal medium으로 배양한 인간 배아줄기세포 H9(WA09) hESCs의 Real-time PCR analysis
표 FGF2 (A,B,C) 또는 DJ1 (D,E,F) 을 포함하는 homemade E8 basal medium으로 배양한 인간 배아줄기세포 H9(WA09) hESCs의 Transmission electron microscopy (TEM) analysis. E= endoplasmic reticulum (ER), V = versicle, G = golgi, M= mitochondria, N= nucleus. B,C,E,F Scale bar = 50 nm, A,D scale bar= 2 μm
표 재조합 단백질 PLGA-FGF2의 dynamic light scattering (DLS) data. PLGA nanoparticle의 평균 사이즈가 185.6 ± 7.1 nm로 측정됨
표 재조합 단백질 PLGA-FGF2를 포함한 homemade E8 basal medium에서 2주 동안 배양한 인간 배아줄기세포 H9(WA09) hESCs의 morphology
표 재조합 단백질 PLGA-FGF2를 포함한 homemade E8 basal medium에서 배양한 인간 배아 줄기세포 H9(WA09) hESCs의 proliferation assay
표 재조합 단백질 PLGA-FGF2를 포함한 homemade E8 basal medium에서 배양한 인간 배아 줄기세포 H9(WA09) hESCs의 Real-time PCR analysis
표 Homemade E8 medium에서 배양한 인간 배아줄기세포 H9(WA09) hESCs의 FACS analysis. 만능성 마커인 SSEA4를 사용하여 FACS analysis를 진행함. H9(WA09) hESCs가 양성반응 (positive staining)을 보임
표 재조합 단백질 Full length Vitronectin, MBP-tVitronectin, MBP-tVitronectin-MBP의 정제 방법
$봉입체 내의 단백질 분리 P: pellet fraction, S: supernatant fraction. P0, cell sonication 후의 pellet fraction; S, 1st wash step 후의 soluble fraction; P1,1st wash step 후의 pellet fraction; S2, 2nd wash step 후의 soluble fraction; P2, 2nd wash step 후의 pellet fraction$ 표 봉입체 내의 단백질 분리 P: pellet fraction, S: supernatant fraction. P0, cell sonication 후의 pellet fraction; S, 1st wash step 후의 soluble fraction; P1,1st wash step 후의 pellet fraction; S2, 2nd wash step 후의 soluble fraction; P2, 2nd wash step 후의 pellet fraction
$봉입체 내 단백질 solubilization (T : 수용화한 후 total fraction, S : 수용화 후 상등액)$ 표 봉입체 내 단백질 solubilization (T : 수용화한 후 total fraction, S : 수용화 후 상등액)
표 Heparin 컬럼을 이용한 full-length vitronectin 정제, B: 컬럼에 결합시키기 전의 단백질, FT: 컬럼에 결합하지 않은 단백질
$봉입체 내의 His8-tVTN 분리 및 수용화, P: pellet fraction, U: Urea로 수용화시킨 단백질$ 표 봉입체 내의 His8-tVTN 분리 및 수용화, P: pellet fraction, U: Urea로 수용화시킨 단백질
표 Ni 컬럼을 이용한 His8-tVTN 정제
$단백질 발현 및 수용성 확인, P: pellet, insoluble fraction, S: supernatant, soluble fraction$ 표 단백질 발현 및 수용성 확인, P: pellet, insoluble fraction, S: supernatant, soluble fraction
표 MBP affinity chromatography를 이용한 MBP-tVTN 정제, B: 컬럼에 결합시키기 전의 단백질, FT: 컬럼에 결합하지않은 단백질, 100% : 50 mM Maltose 포함 용액에서 elution된 단백질
표 MBP-truncated Vitronectin-MBP fusin 단백질 정제, B: 컬럼에 결합시키기 전의 단백질, FT: 컬럼에 결합하지않은 단백질, E : 20 mM Maltose 포함 용액에서 elution된 단백질
표 TEV protease를 이용한 MBP tag 제거, UC (Un-Cut), TEV protease를 처리하기 전 단백질; C (cut), TEV protease
표 Ni chromatography를 이용한 tVTN-MBP 정제, B, 컬럼에 결합시키기 전의 단백질; FT, 컬럼에 결합하지않은 단백질; 5%, 50 mM imidazole 포함 용액에서 elution 된 단백질; 100%, 1M imidazole 포함 용액에서 elution된 단백질
표 Gel permeation chromatography(GPC)을 이용한 tVTN-MBP를 정제. Fraction No.8-10 에서 elution된 tVTN-MBP를 SDS-PAGE로 확인. (Inj., GPC 컬럼에 injection한 단백질)
표 MBP-tVTN-MBP 정제, B: 컬럼에 결합시키기 전의 단백질, FT: 컬럼에 결합지않은 단백질, E: 20 mM Maltose 포함 용액에서 elution된 단백질
표 재조합 단백질 vitronectin, Full length vitronectin, MBP-tVitronectin, MBP-tVitronectin_MBP 코팅 위에서 homemade E8 basal medium을 사용하여 배양한 인간 배아 줄기세포 H9(WA09) hESCs의 morphology
표 재조합 단백질 vitronectin, Full length vitronectin, MBP-truncated-vitronectin, MBP-truncated-vitronectin_MBP 코팅 위에서 homemade E8 basal medium을 사용하여 배양한 인간 배아줄기세포 H9(WA09) hESCs의 Adhesion assay
$MBP- and Ni affinity chromatography를 이용한 TGFb1 정제 시도. S, induction 후 soluble fraction; FT, 컬럼에 결합하지 않은 단백질; Cut, TEV protease를 처리하여 tag cleavage한 후의 단백질; 5%, 50 mM imidazole이 포함된 용액에서 elution된 단백질; 500 mM Imidazole이 포함된 용액에서 elution된 단백질$ 표 MBP- and Ni affinity chromatography를 이용한 TGFb1 정제 시도. S, induction 후 soluble fraction; FT, 컬럼에 결합하지 않은 단백질; Cut, TEV protease를 처리하여 tag cleavage한 후의 단백질; 5%, 50 mM imidazole이 포함된 용액에서 elution된 단백질; 500 mM Imidazole이 포함된 용액에서 elution된 단백질
$Size exclusion chromatography를 이용한 TGFb1 정제 시도. TGFb1 정제 시도 시 size exclusion chromatography의 histogram의 main peak(fraction No. 1-3)의 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인$ 표 Size exclusion chromatography를 이용한 TGFb1 정제 시도. TGFb1 정제 시도 시 size exclusion chromatography의 histogram의 main peak(fraction No. 1-3)의 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인
표 E. coli에서 정제한 BMP4 활성 확인, M-BMP, mammalian cell에서 정제한 단질; E-BMP, E. coli에서 정제한 단백질
표 MBP-Activin A fusion 단백질 정제 및 TEV protease digestion (TEV: fusion (w/w)), B: 컬럼에 결합시키기 전의 단백질, FT: 컬럼에 결합하지 않은 단백질
표 Ni 컬럼을 이용한 Activin A 정제
표 FGF2 단백질 정제
$SP 컬럼을 이용하여 PDIb’a’-FGF2 정제, B: 컬럼에 결합시키기 전의 단백질, FT: 컬럼에 결합하지 않은 단백질, 5-17: elution sample, Fusion protein이 Fraction No.6-17에서 elution되었고 No. 13-17 fraction을 모아 농축함$ 표 SP 컬럼을 이용하여 PDIb’a’-FGF2 정제, B: 컬럼에 결합시키기 전의 단백질, FT: 컬럼에 결합하지 않은 단백질, 5-17: elution sample, Fusion protein이 Fraction No.6-17에서 elution되었고 No. 13-17 fraction을 모아 농축함
$GPC 컬럼을 이용하여 PDIb’a’- FGF2 정제, Inj: injection sample, 8-19: elution sample. Fraction No.10-19에서 elution되었고 No. 14-18 fraction을 모아 PBS로 buffer change$ 표 GPC 컬럼을 이용하여 PDIb’a’- FGF2 정제, Inj: injection sample, 8-19: elution sample. Fraction No.10-19에서 elution되었고 No. 14-18 fraction을 모아 PBS로 buffer change
$Heparin 컬럼을 이용하여 MBP-FGF2 정제, B: 컬럼에 결합시키기 전의 단백질, FT: 컬럼에 결합하지 않은 단백질, Fraction No.22,23에서 elution되었고 No.23 fraction을 PBS로 buffer change$ 표 Heparin 컬럼을 이용하여 MBP-FGF2 정제, B: 컬럼에 결합시키기 전의 단백질, FT: 컬럼에 결합하지 않은 단백질, Fraction No.22,23에서 elution되었고 No.23 fraction을 PBS로 buffer change
표 FGF2-RGD 단백질의 정제
표 대장균에서 생산한 FGF2-RGD를 인간 줄기세포 배양액에 첨가 후 형태학적 비교
표 대장균에서 생산한 FGF2-RGD를 인간 줄기세포 배양액에 첨가 후 Alkaline phosphatase (AP) 분석
표 대장균에서 생산한 FGF2-RGD를 인간 줄기세포 배양액에 첨가 후 proliferation 분석
표 대장균에서 생산한 FGF2-RGD를 인간 줄기세포 배양액에 첨가 후 population doubling time (PDT) 분석
표 대장균에서 생산한 FGF2-RGD를 인간 줄기세포 배양액에 첨가 후 단일세포에서 Alkaline phosphatase (AP) 분석
표 Oncostatin M fusion variant의 도메인 구조(domain structure)
표 8개의 oncostatin M fusion protein이 BL21(DE3) host cell에서 발현 (expression)
표 His6-Oncostatin M이 SHuffle과 Origami 2 host cells에서 발현
표 Oncostatin M fusion protein의 발현과 용해도(solubility)를 다른 E. coli hosts에서 보임. (A) OSM fusion proteins의 발현 (A)과 용해도 (B)를 BL21(DE3) cells에서 보임. (C) His6-OSM의 발현(c)과 용해도 (D)를 3종류의 다른 E. coli host strain에서 보임
$E. coli에서 수용성으로 발현 시킨 MBP-Oncostatin M과 His6-Oncostatin M의 SDS-PAGE analysis. (A) MBP fusion-derived OSM 이 BL21(DE3) cell로 부터 IMAC으로 정제됨. M, molecular weight markers; lane 1, IPTG induction 전의 전체 cell protein, negative control; lane 2, IPTG induction한 전체 cell extract; lane 3, cell sonication 후의 soluble fraction; lane 4, IMAC으로 정제된 MBP-OSM fusion protein (65.95 kDa); lane 5, MBP tag cleavage reaction mixture: TEV protease (28.6 kDa), MBP tag (43.9 kDa), OSM (22.05 kDa); lane 6, TEV cleavage후의 IMAC으로 정제된 OSM ; lanes 7과 8, reducing과 non-reducing 조건에서의 final OSM product (B) His6 fusion-derived OSM이 Origami 2 cell로 부터 IMAC으로 정제됨. M, molecular weight markers; lane 1, IPTG induction 전의 전체 cell protein, negative control, lane 2, IPTG induction한 전체 cell extract; lane 3, cell sonication 후의 soluble fraction; lane 4, IMAC으로 정제된 His6-OSM fusion protein (25.65 kDa); lane 5, His6 tag cleavage reaction mixture: TEV protease (28.6 kDa), His6 tag (3.6 kDa), OSM (22.05 kDa); lanes 6과7, educing과 non-reducing 조건에서의 final OSM product. 화살표(arrows)로 OSM monomers (22.05 kDa), dimers (44.1 kDa), oligomers (≥66.15 kDa)의 position을 표시함$ 표 E. coli에서 수용성으로 발현 시킨 MBP-Oncostatin M과 His6-Oncostatin M의 SDS-PAGE analysis. (A) MBP fusion-derived OSM 이 BL21(DE3) cell로 부터 IMAC으로 정제됨. M, molecular weight markers; lane 1, IPTG induction 전의 전체 cell protein, negative control; lane 2, IPTG induction한 전체 cell extract; lane 3, cell sonication 후의 soluble fraction; lane 4, IMAC으로 정제된 MBP-OSM fusion protein (65.95 kDa); lane 5, MBP tag cleavage reaction mixture: TEV protease (28.6 kDa), MBP tag (43.9 kDa), OSM (22.05 kDa); lane 6, TEV cleavage후의 IMAC으로 정제된 OSM ; lanes 7과 8, reducing과 non-reducing 조건에서의 final OSM product (B) His6 fusion-derived OSM이 Origami 2 cell로 부터 IMAC으로 정제됨. M, molecular weight markers; lane 1, IPTG induction 전의 전체 cell protein, negative control, lane 2, IPTG induction한 전체 cell extract; lane 3, cell sonication 후의 soluble fraction; lane 4, IMAC으로 정제된 His6-OSM fusion protein (25.65 kDa); lane 5, His6 tag cleavage reaction mixture: TEV protease (28.6 kDa), His6 tag (3.6 kDa), OSM (22.05 kDa); lanes 6과7, educing과 non-reducing 조건에서의 final OSM product. 화살표(arrows)로 OSM monomers (22.05 kDa), dimers (44.1 kDa), oligomers (≥66.15 kDa)의 position을 표시함
표 Peptide의 LC-MS/MS sequencing을 두 종류의 enzyme-digested samples
표 Inhibitory effect of the commercial and purified Oncostatin M proteins on the differentiation of CD4+ T cells into Th17 cells. CD4+ T cells을 commercial 또는 정제된 Oncostatin M 으로 Th17 cell-polarising 조건에서 처리함 (n=3). 72 시간 후에 culture supernatants의 IL-17 레벨을 ELISA로 anaylsis 함(A). the cells treated with 10 ng/mL OSM proteins을 처리한 cell의 IL-17의 intracellular 레벨을 다른 CD4+ T cells에서 flow cytometry에서 analysis 함(B). (+), commercial OSM; His, His-OSM에서 정제된 OSM; MBP, MBP-OSM에서 정제된 OSM
표 사람 배아줄기세포 형태
표 사람배아줄기세포에서의 OCT4와 SSEA4 발현
표 수립된 배아줄기세포에서의 정상 염색체
표 사람배아줄기세포에서의 mtDNA copy number 분석
표 다양한 유래의 fibroblast를 이용하여 seahorse assay를 통한 mitochondrial function분석법 확립
표 hESO8의 mtDNA mutation 분석 결과
표 hESO12의 mtDNA mutation 분석 결과
표 hESO13의 mtDNA mutation 분석 결과
표 hESO14의 mtDNA mutation 분석 결과
표 hESO17의 mtDNA mutation 분석 결과
표 iPSC clone에서의 mtDNA mutation 분석 결과
표 연구개발의 목표
표 연구개발의 내용
표 MatrigelTM의 주요구성
표 코팅제 개발의 모식도
표 RGD 융합 FGF2의 entry vector 모식도
표 태그 융합 단백질 발현 벡터. A tVTN 유전자를 삽입한 엔트리 벡터 및 태그 융합 단백질 발현 벡터의 제작과정. B tVTN의 N-말단에 8개의 태그가 융합된 융합 단백질의 모식도
표 FGF2개발 모식도
표 FGF2-PLGA 모식도

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