[보고서]신규 전환인자 발굴을 통한 임상가능 순수 인간만능줄기세포 전환기술 개발

류춘제

보고서 정보

주관연구기관

세종대학교
Sejone university

연구책임자

류춘제

참여연구자

이태희

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2019-01

과제시작연도

2018

주관부처

과학기술정보통신부
Ministry of Science and ICT

연구관리전문기관

한국연구재단
National Research Foundation of Korea

등록번호

TRKO202000006501

과제고유번호

1711065554

사업명

바이오.의료기술개발(R&D)

DB 구축일자

2020-07-29

키워드

인간 순수 만능줄기세포.인간 준 만능줄기세포.인간 체세포.세포 전환.단일클론항체.human naive pluripotent stem cell.human naive pluripotent stem cell.human somatic cell.cell conversion.monoclonal antibody.

표 naive hPSC연구를 위한 전반적인 모식도
표 Naive 인간 iPSC 제작을 위한 가설
표 naive hiPSC 연구개발 전체모식도. NBL2, N2B27/LIF (leukemia inhibitory factor) medium에서 수립된 naive iPSC colony #2; △PE, proximal enhancer deletion; EOS, Oct4 NG, Nanog-GFP; O△P, Oct4-△PE; Dox, doxycycline; VN, vitronectin; SMC, smooth muscle cells
표 생쥐배아줄기세포와 인간배아줄기세포 차이점 비교
표 Primers of naive and primed genes
표 Construction of primed H9 cells with pLenti-Oct4-GFP, pLenti-ΔDE-Oct4-GFP, or pLenti-ΔPE-Oct4-GFP reporters
표 Morphological analysis of hPSC cultures in primed media and different naive media. Primed H9, CHA-hES4와 iPS-NT4 세포는 크고, 납작한 형태의 colony (large and flat colony) 모양을 보이지만, naive로 전환시킨 2i/L/F/A, 2i/L/X/F/P와 LCDM media에서 배양한 세포는 상대적으로 작고, 촘촘한 dome 형태의 colony (small and compacted dome-shape colony)를 보임
표 Expression of primed- and naive-specific genes in primed H9 and naive H9 (H9-2i/L/F/A) cells. primed H9 세포와 naive H9 (H9-2i/L/F/A) 세포에서 naive gene과 primed gene의 발현비교. H9-2i/L/F/A 세포에서 대부분의 naive gene의 발현이 primed H9 세포에 비해 크게 증가했고, primed gene인 Otx2와 Dnmt3B가 현저히 감소함을 보임
표 Expression of primed- and naive-specific genes in primed H9 and naive H9 (H9-2i/L/X/F/P) cells. primed H9 세포와 naive H9 (H9-2i/L/X/F/P) 세포에서 naive gene과 primed gene의 발현비교. H9-2i/L/X/F/P 세포에서 대부분의 naive gene의 발현이 primed H9 세포에 비해 상대적으로 증가했고, primed gene인 Otx2, Sox17와 Dnmt3B가 현저히 감소함을 보임.(3) Primed 인간 만능줄기세포의 surface marker 발현 비교
표 Surface marker expression of naive and primed hPSCs in primed H9 and H9-2i/L/F/A and H9-2i/L/X/F/P cells. H9-2i/L/F/A와 H9-2i/L/X/F/P 세포에서 primed surface marker인 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, CD24 및 CD90의 발현이 상대적으로 감소하고, 최근에 보고된 naive surface marker인 CD7, CD77, 및 CD130 발현이 상대적으로 증가하는 것을 보임. 실선은 각 항체의 결합력을 나타내고, 붉은 바탕은 2차 항체만 포함한 것임
표 Mycoplasma contamination test of primed and naive H9 hPSCs. primed H9과 H9-2i/LF/A 및 2i/L/X/F/P 세포에서 mycoplasma가 검출되지 않음
표 Experimental strategy for generation of naive hPSC-specific mAbs. (1) primed H9 세포를 2i/L/F/A와 2i/L/X/F/PV medium에서 naive state로 전환한 후 naive 및 primed gene의 발현 확인 (2) primed 및 naive H9 세포를 이용하여 decoy immunization 수행 (3) popliteal lymph node와 myeloma 세포의 fusion을 통해 hybridoma 제조 (4) Sandwich ELISA와 FACS을 통해 항체를 생산하는 hybridoma 선별 (5) 우선 naive H9의 세포표면을 인식하는 hybridoma clone을 선별 (6) 이후 naive H9 세포의 세포내부를 인식하는 hybridoma clone을 선별하는 방식으로 진행함
표 Generation of hybridoma clones by decoy immunization. 항체를 생산하는 616개의 hybridoma clone 중 129개 세포표면을 인식하는 clone과 166개 세포내부를 인식하는 clone을 얻었고, 본 연구의 목적에 맞는 naive hPSC-specific mAbs는 163개 clone을 얻음
표 Representative naive hPSC-specific surface mAbs. naive H9 세포에는 결합하지만 primed H9 및 MEF 세포에는 결합하지 않거나 약하게 결합하는 단일클론항체군
표 FACS profile of naive hPSC-specific surface mAbs
표 Representative naive/primed hPSC-both positive surface mAbs. naive 및 primed H9 세포에는 결합하지만 MEF 세포에는 결합하지 않거나 약하게 결합하는 단일클론항체군
표 FACS profile of naive/primed hPSC-both positive surface mAbs
표 Representative primed hPSC-specific surface mAbs. primed H9세포에는 결합하지만, naive H9 및 MEF 세포에는 결합하지 않거나 약하게 결합하는 단일클론항체군
표 FACS profile of primed hPSC-specific surface mAbs
표 FACS profile of naive-specific intracellular mAbs
표 FACS profile of naive/primed both-positive intracellular mAbs
표 FACS profile of primed-specific intracellular mAbs
표 FACS profile of naive hPSC-specific surface mAbs in various cancer cells
표 Antibody purification. protein G-Sepharose column을 이용하여 정제한 후 CBB staining solution과 anti-mouse IgG-HRP 2차 항체를 이용하여 heavy chain (중쇄)와 light chain (경쇄)을 확인함
표 Immunoprecipitation using naive hPSC-specific surface mAbs. 각 항체에 의해 특이적으로 면역침강된 약 43KDa (A), 60KDa (A), 28KDa (B), 50KDa (C), 75KDa (D), 63KDa (E) 단백질 (적색 화살표). SA-HRP ; streptavidin-HRP
표 Binding capacity of N1-A4 in various cells. (A) Primed H9, CHA-hES4, iPS-NT4-S1과 naive H9-2i/L/F/A, H9-2i/L/X/F/P, H9-LCDM과 CHA-hES4-2i/L/F/A, CHA-hES4-2i/L/X/F/P, CHA-hES4-LCDM과 iPS-NT4-S1-2i/L/F/A, iPS-NT4-S1-LCDMH9 세포 결합분석. (B) mESC(R1), MEF, 다양한 cancer cells에서 N1-A4 항체의 결합력. 실선은 항체의 결합력을 나타내고, 회색 또는 빨간 바탕은 2차 항체만 포함한 것임
표 Identification of N1-A4 antigen. N1-A4 항체에 의해 특이적으로 면역침강된 60KDa 단백질을 Instant Blue staining solution으로 염색 (A) 한 후 LC-MS/MS 분석을 통해 mitochondrial chaperonin으로 알려진 heat shock protein 60 (HSP60)으로 동정되었고, match되는 peptide와 이 peptide의 아미노산 서열 표시 (밑줄 및 적색) (B), Goat HSP60(K-19) 항체를 이용하여 N1-A4와 HSP60(K-19) 항체가 면역침강한 단백질을 HSP60(K-19)에 의해 검출됨 (C)
표 Analysis of N1-A4 antigen. N1-A4 항원이 HSP60인지를 재확인하기 위해서, pFlag-HSP60 vector와 pcDNA3.1(+)-HSP60-Myc/His vector를 제조해서 Flag- 또는 Myc-tagging HSP60의 정상적인 발현을 확인한 후(A,C), 두 vector를 transfection한 293FT 세포를 anti-Flag, anti-Myc, anti-His, anti-HSP60 및 N1-A4 항체를 이용하여 면역침강을 한 결과 N1-A4 항체가 면역침강 시킨 항원이 anti-Flag과 anti-Myc 항체에 의해 검출됨을 보여줌 (B,D,E). HC ; 항체의 heavy chain (중쇄)
표 Structure and sequence of HSP60 shRNA. Nhe1과 EcoR1 overhang 및 Spe1 loop sequence를 포함한 sense 및 anti-sense HSP60 shRNA oligo
표 Annealing of HSP60 shRNA oligos. sense 및 antisense HSP60 shRNA oligo를 10x NEB buffer를 이용해서 annealing (A)을 하고, ATP와 T4-PNK를 통해 인산화를 한 후, Nhe1과 EcoR1으로 digestion한 EZ-Tet-pLKO-puro vector (B)에 ligation 수행함
표 Colony PCR of ligated clones. 성공적으로 ligation된 colony를 picking하여 ampicillin (100ug/ml)이 들어있는 LB medium에서 2시간 동안 배양한 후 pLKO(F) 5′ -ATTAGTGAACGGATCTCGACGG와 pLKO(R) 5′-AACCCAGGGCTGCCTTGG primer를 이용하여 PCR 수행한 결과 positive clone (456bp)을 보여줌
표 Vector validation of Tet-pLKO-HSP60 shRNA vectors. DNA purification 한 후 Spe1 효소 처리를 통해 성공적인 cloning 상태를 확인함
표 Knockdown efficiency of Dox-inducible Tet-pLKO-HSP60 shRNA vector. Tet-pLKO-HSP60 shRNA를 stable하게 발현하는 293FT 세포에 pFlag-HSP60 vector를 transfection 한 후 Doxycyclin (2μg/ml)을 처리하여 HSP60 shRNA의 knockdown efficiency를 보여줌. Dox(+)/Recovery ; Doxycyclin 제거후 24시간
표 PCR analysis of variable region genes in heavy (A) and light (B) chains of N1-A4
표 Amino acid sequence of N1-A4 heavy chain. N1-A4 의 중쇄는 서브그룹 IIC 에 속하고, CDR 잔기는 CDR1 은 23-35, CDR2 는 50-65, CDR3 는 95-102 에 해당함
표 Amino acid sequence of N1-A4 light chain. N1-A4 의 경쇄는 서브그룹 V 에 속하고, CDR 잔기는 CDR1 은 24-34, CDR2 는 50-56, CDR3 는 89-97 에 해당함
표 Flow cytometry analysis of various naive hPSCs with N16-F2. Primed H9, CHA-hES4, iPS-NT4-S1과 3가지 primed 세포를 2i/L/F/A, 2i/L/X/F/P, LCDM 배지에서 배양한 9가지 naive 인간 만능줄기세포에 대한 N16-F2의 결합력. 실선은 N16-F2, 회색바탕은 2차 항체만 반응시킨 것임
표 Flow cytometry analysis of various cancer and primary cells with N16-F2. Primed H9, 생쥐 배아줄기세포(R1) MEF, 인간 배아암(NT-2, 2102EP, NCCIT) 세포, 다양한 암세포 및 정상 혈액세포 (PBMC)에 대한 단일클론 항체 N16-F2의 결합력. 실선은 N16-F2의 결합력, 회색바탕은 2차 항체만 반응시킨 것임
표 Identification of N16-F2 antigen. 같은 N16-F2에서 유래한 c1 and c2 단일클론항체 항원을 LC-MS/MS로 동정함. (A) 단일클론항체 N16-F2의 c1과 c2에 의해 면역 침강된 단백질 (A, 적색화살표). (B-C) 동정된 CA14와 match되는 peptide와 이 peptide의 아미노산 서열 표시 (밑줄 및 적색)
표 N16-F2 (c1 and c2) antigen analysis using commercial CA14 antibody. N16-F2 의 c1 과 c2, rabbit polyclonal anti-CA14 (GTX81537, Gene Tex) 항체에 의해 면역침강된 단백질을 rabbit polyclonal anti-CA14 항체로 웨스턴 블랏 확인한 결과 rabbit anti-CA14 항체는 CA14 의 isoform (glycosylated)이 잘 잡고, N16-F2 항체는 isoform 보다 45kDa 의 원래 형태를 더 잘 잡는 것을 볼 수 있음
표 Analysis of N16-F2 antigen. N16-F2 항원이 CA14인지를 재확인하기 위해서, pcDNA3.1(+)-CA14-Myc/His vector를 제조해서 Myc-tagging CA14의 정상적인 발현을 확인한 후(A), pcDNA3.1(+)-CA14-Myc/His vector를 transfection한 293FT 세포를 anti-Myc, rabbit anti-CA14 및 N16-F2-c1, N16-F2-c2 항체를 이용하여 면역침강을 한 결과 N16-F2 항체가 면역침강 시킨 항원이 anti-Myc 항체에 의해 검출됨을 보여줌(B). HC ; 항체의 heavy chain (중쇄)
표 Structure and sequence of CA14 shRNA. Nhe1과 EcoR1 overhang 및 Spe1 loop sequence를 포함한 sense 및 anti-sense CA14 shRNA oligo
표 Annealing of CA14 shRNA oligos. sense 및 antisense CA14 shRNA oligo를 10x NEB buffer를 이용해서 annealing을 수행함. ss; single strand, ds; double strand
표 Colony PCR and vector validation of Tet-pLKO-CA14 shRNA. (A) 성공적으로 ligation된 colony를 picking하여 ampicillin (100 μg/ml)이 들어있는 LB medium에서 2시간 동안 배양한 후 pLKO(F) 5′-ATTAGTGAACGGATCTCGACGG와 pLKO(R) 5′ -AACCCAGGGCTGCCTTGG primer를 이용하여 PCR 수행한 결과 positive clone (456bp)이 확임됨. (B) DNA purification 한 후 Spe1 효소 처리를 통해 성공적인 cloning 상태를 확인함
표 PCR analysis of variable region genes in heavy (A) and light (B) chains of N16-F2
표 Amino acid sequence of N16-F2 heavy chain. N16-F2 의 c1 과 c2 항체의 중쇄는 서브그룹 IIA 에 속하고, 항원을 인식하는 CDR1 은 23-35, CDR2 는 50-66, CDR3 는 99-104 에 해당함
표 Amino acid sequence of N16-F2 light chain. N16-F2 의 c1 과 c2 항체의 경쇄는 서브그룹 I 에 속하고, 항원을 인식하는 CDR 잔기는 CDR1 은 24~39, CDR2 는 55~62, CDR3 는 94~102 에 해당함
표 Flow cytometry analysis of various naive hPSCs with N49-A7. Primed H9, CHA-hES4, iPS-NT4-S1과 3가지 primed 세포를 2i/L/F/A, 2i/L/X/F/P 및 LCDM 배지에서 배양한 9가지 naive 인간 만능줄기세포에 대한 N49-A7의 결합력. 실선은 N16-F2의 결합력, 빨간바탕은 2차 항체만 반응시킨 것임
표 Flow cytometry analysis of various cancer and primary cells with N49-A7. MEF, 인간 배아암 세포 (NT-2, 2102EP, NCCIT), 다양한 암세포 및 정상 혈액세포 (PBMC)에 대한 단일클론 항체 N49-A7의 결합력. 실선은 N49-A7의 결합력, 빨간 바탕은 2차 항체만 반응시킨 것임
표 Identification of N49-A7 antigen. (A) 2102EP세포에서 N38-B2와 N49-A7 단일클론항체로 항원을 면역침강하고 Instant Blue staining을 하고 잘라서 LC-MS/MS로 동정하였다. (B) 단일클론항체 N38-B2, N49-A7와 상업용 항체 HSC70항체로 면역침강(IP)한 후 면역 침강된 단백질을 HSC70 항체로 검출함 (검은 화살표)
표 Identification of N49-A7 antigen. N49-A7에 의해 면역침강된 항원에서 동정된 HSC70와 match되는 peptide와 이 peptide의 아미노산 서열 표시 (밑줄 및 적색)
표 PCR reaction of variable region genes in heavy (A) and light (B) chain of N49-A7
표 Flow cytometry analysis of primed/naive hPSCs, various cancer cells and primary cells with NPB24. (A) primed 와 naive hPSCs, MEF, 인간 배아암 세포 (NT-2, 2102EP), 다양한 암세포 및 정상 혈액세포 (PBMC)에 대한 단일클론 항체 NPB24의 결합력. 실선은 N49-A7의 결합력, 빨간 바탕은 2차 항체만 반응시킨 것이다 (B) NPB24 항원의 면역침강. 2102EP세포 표면을 biotinylation 한 후 NPB24항체로 면역침강하고 SA-HRP로 검출함
표 Flow cytometry analysis of primed and naive hPSCs with 4A68, 108-B6 and 297-D4
표 Detection of intracellular antigens using naive hPSC-specific intracellular mAbs. N133, N134, N60, N116 항체가 인식하는 52KDa (A), 55KDa (B), 37KDa (C), 24KDa (D)의 세포내부 단백질을 인식함을 western blotting을 통해 확인하였다
표 naive 리프로그래밍 lentiviral vector 구축
표 pMXs 레트로바이러스 벡터기반 2중프로모터에 의한 리프로그래밍 인자 발현
표 인간평활근세포로부터 inducible OSKM 발현 렌티바이러스와 배양 조건의 변화에 의한 naive iPSC 수립
표 naive iPSC 배양 시 cytokine 의존도 조사
표 수립된 naive iPSC들의 in vitro 분화능 조사
표 VP64 함유 리프로그래밍 인자 제작 모식도
표 VP64 함유 리프로그래밍 인자에 의한 인간평활근세포에서 iPSC 제작
표 동일 인간평활근세포 유래 naive & primed iPSCs 제작 및 특성 분석
표 수립된 iPSC들에서 naive 특이 마커 발현 및 NBL2-O△PG-iPSC를 이용한 리프로그래밍 화합물의 개별 naivety 조사
표 나이브 리프로그래밍 세포주 수립 및 나이브 리프로그래밍 신호전달 연구

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