[보고서]전분화능 줄기세포로부터 중뇌 흑질부 특이적 도파민 신경세포의 효율적 분화법 개발을 통한 신경계 질환 세포치료 원천기술 개발

김동욱

보고서 정보

주관연구기관

연세대학교
Yonsei University

연구책임자

김동욱

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2017-04

과제시작연도

2016

주관부처

미래창조과학부
Ministry of Science, ICT and Future Planning

등록번호

TRKO202000007310

과제고유번호

1711038413

사업명

바이오.의료기술개발

DB 구축일자

2020-09-26

키워드

전분화능 줄기세포.신경세포 분화.도파민 신경세포.중뇌 흑질부.파킨슨병.pluripotent stem cells.neural differentiation.dopaminergic neurons.substantia nigra.Parkinson's disease.

표 (좌) 미국 Geron社에서 최초로 시행된 인간 배아줄기세포유래 희소돌기교세포의 척수손상환자를 대상으로 한 임상시험을 소개한 미국 Wall Street Journal紙기사의 일부. (우) 미국 ATC社에서 시행하는 노인성 황반변성증 환자를 대상으로 한 인간 배아줄기세포 유래 망막색소상피세포 이식을 소개하는 The Independent紙기사의 일부
표 낙태아 중뇌조직의 이식을 통한 파킨슨병 치료 전략 (Lindvall et al. 2003)
표 뇌 여러 부분에 존재하는 도파민 신경세포 (빨간색 표시부분) (a) 쥐 뇌의 횡단면 및 (b) 종단면. SNc라고 표시된 부위가 중뇌 흑질부 (A9 부위)임
표 파킨슨병 모델에 A10 부위 도파민 전구세포와 A9부위 도파민 전구세포를 각각 이식한 후 대조군과 비교해 보았을 때 A10 부위 도파민 전구세포를 이식한 경우보다 A9부위 도파민 전구세포를 이식한 경우에서 Amphetamine-유발 회전수가 훨씬 유의하게 감소하였고 (A), cylinder test에서는 A9부위 도파민 전구세포를 이식한 경우에서만 정상쥐 수준으로 회복되는 것으로 확인되었다 (B). [Grealish et al. 2009]
표 인간 전분화능 줄기세포로부터 중뇌 특이적 신경전구세포로 분화시키기 위하여 GSK-3 inhibitors (BIO, 1-Azakenpaullone (1-AKP), CHIR99021 (CHIR) and LiCl)를 적정 농도로 처리한 결과 중뇌 특이적 마커인 En1의 발현이 증가하였으며, 전뇌와 후뇌의 마커인 Bf1, Gbx2의 발현은 감소하는 현상을 확인함
표 중뇌 특이적 신경전구세포의 형성 및 유지에 FGF8 신호도 기여하고 있음을 확인. GSK-3 inhibitor 인 BIO와 함께 FGF8를 처리하였을 때 중뇌성 형성에 좀 더 효과가 있음을 확인함과 동시에 FGF blocker인 SU5402를 함께 처리하면 그 효과가 BIO만 처리한 것보다도 감소하는 것을 확인함. 이는 세포내 내재적 FGF 신호가 중뇌성 형성에 기여하고 있음을 시사함. 또한, BIO를 처리하였을 때 세포내 FGF8 신호전달물질이 더욱 증가함을 확인함
표 (A) BIO를 처리한 후 경과 시간별로 신경전구세포에서 En1과 β-catenin의 단백질 발현을 immunoblotting으로 살펴봄. BIO를 처리한 후 30 분 이후부터 β-catenin과 En1의 발현이 증가함을 확인함. (B) 인간 전분화능 줄기세포로부터 유도분화한 신경전구세포에 BIO를 처리한 후 날짜별로 β-catenin과 TCF4 간의 결합을 co-immuno precipitation을 통하여 확인. BIO 처리 후 날짜가 지날수록 β-catenin과 TCF4 간의 결합이 증가함. 따라서 이들은 세포내에서 결합체를 이루어 En1의 발현에 영향을 준다는 것을 알 수 있음
표 중뇌 마커인 En1을 발현하는데 β-catenin과 FGF8의 신호전달기전의 연관성을 확인하기 위하여 β-catenin의 siRNA를 처리하여 En1의 발현과 FGF8의 발현량을 각각 확인하여 봄. En1의 발현은 siRNA-β-catenin에 의하여 감소됨을 보였으나 FGF8의 발현은 이와 β-catenin의 양에 의존하지 않는다는 것을 확인함. 이전의 연구에서 En1의 발현은 Wnt 신호전달체계와 더불어 FGF8 신호전달체계도 관여한다는 것을 확인함. 하지만, 이번 실험을 통하여 Wnt와 FGF8 신호전달체계가 서로 의존적으로 En1를 조절하는 것은 아니라는 것을 알 수 있었음
표 GSK3 inhibitor 처리 후 Wnt/β-catenin 신호전달체계에 의해 En1의 발현이 증가하는 현상에서 FGF8의 영향을 확인하기 위하여 FGF8의 하위 molecule인 JNK, Erk, NF-kB 신호전달체계에 대한 inhibitor를 처리하여 En1과 FGF8 의 발현을 확인. GSK3 inhibitor를 처리하여 Wnt 신호전달체계를 유도시킨 후, FGF8에 관련된 신호를 억제하여도 영향을 받지 않는다는 것을 알 수 있음. 따라서 Wnt 신호와 FGF8 신호는 별도의 신호전달체계로 En1의 발현에 영향을 미침을 확인
표 ChIP assay를 실시하기 위한 En1 promoter 부위 primer 제작 (TCF4 결합 부위, Patch 1.0 provided by Transfac®)
표 β-catenin/TCF4 결합 부위로 추정되는 부분을 TCF4와 β-catenin 각각의 antibody를 이용하여 ChIP assay 후 real-time PCR로 확인한 결과 (A) TCF4와 (B) β-catenin이 En1의 promoter에 직접 결합한다는 것을 확인함
표 En1의 promoter를 luciferase expressing vector에 삽입하여 β-catenin 또는 TCF4에 의해 luciferase가 발현되는지의 여부를 통해 β-catenin/TCF4 complex와 En1 promoter의 결합 여부를 확인함. En1 promoter 부위를 전체를 클로닝한 것과 (En1-Full), En1 promoter 부위를 3 개의 조각으로 나눈 것 (En1-Head, Mid, Tail)에서 constant active mutant form인 β-catenin 4A와 wild type TCF4 (WT-TCF4)에 의해 luciferase 활성이 증가하는 것을 확인함. 또한 β-cateinin 4A와 WT-TCF4를 동시에 도입한 조건에서는 luciferase 활성이 현저하게 증가함. 한편 dominant negative TCF4를 도입하였을 때는 luciferase 효과에 별다른 변화가 없었으나, β-catenin 4A와 DN-TCF4를 같이 도입시킨 조건에서는 유의미하게 감소함
표 (A) 신경전구세포 기간 동안 BIO를 처리한 실험군에서 도파민 신경세포의 마커인 TH의 발현을 신경세포 마커 Tuj1과 공염색을 통해 그 발현량을 대조군과 비교하여 확인하고 그 비율을 그래프로 나타냄. (B) 도파민 신경세포에서 발현하는 AADC를 TH와 공염색하여 확인하고, DBH를 TH와 공염색하여 BIO를 처리한 세포에서 노르에피네프린 신경세포가 만들어지지 않았다는 것을 보여줌
표 도파민 신경세포에서 중뇌 흑질부 (A9부위) 특이적 마커인 Pitx3와 Girk2의 유전자 수준에서의 발현이 대조군에 비해 현저히 높아짐을 확인하였고, A10 특이적 마커인 Calbindin은 BIO를 처리한 후 분화시킨 신경세포에서 대조군에 비해 현저히 낮아짐을 확인
표 (A) 신경전구세포에 BIO를 처리한 후 분화된 도파민 신경세포에서 시냅스 형성을 할 수 있는 단백질인 synaptophysin이 발현하고 있음을 TH와 공염색을 통하여 확인. (B) 성숙한 도파민 신경세포로부터 도파민이 분비되고 있음을 HPLC 실험을 통해 확인. (C, D, E) 분화된 도파민 신경세포의 전기생리학적 특성을 분석하여 기능성 있는 신경세포임을 확인
표 인간 전분화능 줄기세포에서 유도분화된 신경전구세포가 중뇌 흑질부 (A9부위) 도파민 전구세포가 발생 시 위치하는 신경관의 Floor plate의 특성을 갖도록 하기 위해 화학작용물질인 SAG를 농도별로 처리하여 SHH 신호를 활성화시킴으로써 배쪽화를 유도함
표 신경관 바닥판의 특성인 FOXA2가 발현하는 분화조건을 확보하고 배쪽화와 중뇌화를 동시에 진행하여 중뇌 마커인 EN1의 발현을 유도하였음. 중뇌화를 유도하는 Wnt 신호를 활성화하기 위한 화학작용물질인 CHIR99021와 배쪽화를 유도하는 SHH 신호를 활성화하기 위한 화학작용물질인 SAG를 동시에 농도별로 처리하여 중뇌마커인 EN1, 신경관의 바닥판마커인 FOXA2, 그리고 도파민 전구세포 마커인 LMX1A가 모두 발현하는 조건을 확립하였음. CR, CHIR99021
표 중뇌화의 Wnt 신호전달체계와 배쪽화의 SHH 신호전달체계가 서로간의 어떻게 영향을 받는지를 등쪽, 기저, 그리고 배쪽을 구분하여 각각의 마커들로 확인하였음. Wnt 그리고 SHH 신호전달체계는 각각의 화학작용물질 및 재조합 단백질의 신호를 받아 등쪽, 기저, 그리고 배쪽의 특성을 나누는데 역할을 하고 있었으며, 본 실험에서 요구되는 중뇌, 배쪽, 그리고 도파민 전구세포의 특성을 Wnt 그리고 SHH의 신호전달을 조절하여 얻을 수 있다는 것을 확인하였음. CR, CHIR99021
표 Wnt와 SHH 신호를 화학작용물질로 조절하여 중뇌 흑질부 (A9부위) 도파민 전구세포를 확립하였으나 증식을 하면서 확립된 특성을 유지하는지 확인이 필요하였음. 유도분화된 중뇌도파민 전구세포를 단일세포로 분리 후 증식을 하면서 확립된 특성이 변하는지, 그리고 확립된 특성을 증진시킬 수 있는지를 관련 신호전달체계를 증식과정 중 조절하여 중뇌 마커인 EN1과 도파민전구세포 마커인 LMX1A가 Wnt 신호를 화학작용물질로 유지 시 발현이 증가함을 확인하였음. CR, CHIR99021
표 Wnt 신호의 화학작용물질인 CHIR99021과 SHH 신호의 화학작용물질인 SAG의 농도 조절을 통해 인간 배아줄기세포로부터 중뇌 흑질부 (A9부위) 도파민 신경세포로 유도분화하는 분화법을 개발함
표 인간 배아줄기세포 (H9)외에 인간 역분화 줄기세포 (HDF-epi3)에서도 중뇌 흑질부 (A9부위) 도파민 세포의 유도분화를 증명하여, 본 분화법이 인간 전분화능 줄기세포에서 일반적으로 적용가능하다는 것을 확인하였음. 분화과정 중에 Wnt와 SHH 신호를 화학작용물질로 조절함으로써 중뇌마커인 EN1, 신경관의 Floor plate마커인 FOXA2, 그리고 도파민 전구세포 마커인 LMX1A가 모두 발현하는 중뇌 도파민 전구세포의 발생을 인간 역분화 줄기세포에서 유도할 수 있음을 확인하였음. CR, CHIR99021
표 중뇌 도파민 전구세포의 성숙한 도파민 신경세포로의 분화. 중뇌 도파민 전구세포에서 발현하는 LMX1A와 FOXA2가 성숙한 도파민 신경세포로 분화 후에도 발현을 유지함 (A). 도파민 신경세포의 마커인 TH와 신경세포의 마커인 TUBB3가 동시에 발현하는 세포를 확인함으로써 도파민 신경세포임을 확인하였으며 (B), 또한 성숙한 신경세포의 마커인 NeuN이 TUBB3와 동시에 발현하는 것을 확인함으로써 도파민 신경세포가 성숙한 신경세포임을 확인함 (C)
표 중뇌 도파민 전구세포의 성숙한 중뇌 특이적 도파민 신경세포로의 분화. 도파민 신경세포의 마커인 TH와 성숙한 중뇌 특이적 도파민 신경세포의 발생과 유지에 역할을 하는 NURR1이 동시에 발현함을 확인하였으며 (A), TH와 성숙한 중뇌 도파민 신경세포의 발생과 유지의 역할을 하는 또 다른 마커인 PITX3의 발현 또한 확인함으로써 중뇌 도파민 신경세포의 분화를 확실히 증명함 (B). 신경세포의 마커인 TUBB3를 발현하는 신경세포에서 유사분열을 하는 세포가 발현하는 KI67이 발현하지 않음을 확인함으로써 분화된 중뇌 도파민 신경세포가 모두 성숙한 신경세포임을 확인함 (C)
표 인간 전분화능 Lmx1a-EGFP Knock-In (KI) reporter 세포주 확립 전략. Lmx1a 유전자의 종결코돈 주변을 인식하는 TALEN을 제작하고 DNA 이중가닥 파손 부위에서 상동성 유전자 재조합 (homology directed repair, HDR)에 의해 EGFP reporter cassette이 유전체 내에 삽입되도록 Donor DNA를 제작함
표 인간 전분화능 Lmx1a-EGFP Knock-In (KI) reporter 후보 세포주의 유전체 내 Reporter cassette 삽입 확인. (A) LA-F와 LA-R primer를 이용하여 Left arm region에서, RA-F와 RA-R primer를 이용하여 Right arm region에서 Knock-In (KI) 여부를 PCR을 통해 확인함. KI-F와 KI-R primer를 이용하여 유전체의 대립유전자 모두에 삽입되었음을 확인함. (B) 각 primer를 이용한 PCR 결과를 확인. Knock-In (KI)이 되었을 경우 LA와 RA는 각각 1.5 kb, 2.0 kb의 PCR 생성물이 나타나며, KI-F와 KI-R primer에 의해 3.6 kb의 PCR 생성물이 확인됨. (C) LA와 RA PCR 생성물을 DNA 염기서열을 분석하여 확인함
표 인간 전분화능 Lmx1a-EGFP Knock-In (KI) reporter 후보 세포주의 인간 전분화능 줄기세포 특성을 분석. 확립한 Lmx1a-EGFP Knock-In (KI) reporter 후보 세포주에서 인간 전분화능 줄기세포 특이적 마커의 발현을 단백질 수준 (A)과 RNA 수준 (B)에서 확인하였으며, 이 세포주가 정상 핵형임을 확인함 (C)
표 인간 전분화능 Lmx1a-EGFP Knock-In (KI) reporter 세포주 확인. 확립한 Lmx1a-EGFP Knock-In (KI) reporter 세포주의 도파민 신경세포 분화법을 이용하여 유도분화과정 중 도파민 전구세포 단계 (분화 20일)에서 EGFP의 발현을 확인하였음 (A). 이 reporter 세포주의 분화 진행과정 중의 LMX1A의 발현은 도파민 전구세포 단계까지 계속해서 증가함을 RNA 수준에서 확인하였으며, 이때 EGFP의 발현도 LMX1A 발현의 경향과 유사하게 증가하였음 (B). EGFP의 발현으로 LMX1A의 발현을 추적할 수 있음을 확인하였으며, 이 단계의 세포는 도파민 전구세포 마커인 EN1, FOXA2, LMX1A 를 발현함. 특히, LMX1A를 발현하는 세포는 EN1과 FOXA2를 발현하는 EN1-FOXA2-LMX1A triple-positive 세포임을 확인함
표 중뇌 도파민 전구세포 단계에서 EGFP 양성 세포의 분리. (A) 확립한 Lmx1a-EGFP Knock-In (KI) reporter 세포주를 중뇌 도파민 전구세포로 유도분화하여 EGFP의 발현을 확인. (B) 중뇌 도파민 전구세포에서 EGFP 양성인 세포는 약 30% 정도이며, 형광활성화 세포분류기를 이용한 세포 분리를 시도함
표 중뇌 도파민 전구세포의 신경전구세포적 특성. 인간 전분화능 Lmx1a-EGFP Knock-In (KI) reporter 세포주를 중뇌 도파민 전구세포로 유도분화하여 EGFP의 발현 여부로 형광활성화 세포분류를 진행함. LMX1Aunsorted, LMX1A+, LMX1A- 그룹에서 신경전구세포 마커인 NESTIN, SOX1, SOX2, KI67의 발현을 확인하였음
표 중뇌 도파민 전구세포 단계에서 분리한 EGFP 양성세포 및 음성세포의 특성 분석. 인간 전분화능 Lmx1a-EGFP Knock-In (KI) reporter 세포주를 중뇌 도파민 전구세포로 유도분화하여 형광활성화 세포분류기를 이용하여 EGFP 양성 및 음성 세포로 분리하고 이 세포들을 중뇌 도파민 신경세포 발생과 관련된 유전자 중 앞-뒤 축 형성 관련 유전자 (A), 등-배축 형성 관련 유전자 (B) 그리고 중뇌 도파민 신경세포 lineage specification 관련 유전자 (C)의 발현을 확인함
표 인간 전분화능 Pitx3-mCherry Knock-In (KI) reporter 세포주 확립 전략. Pitx3 유전자의 종결코돈 주변을 인식하는 sgRNA를 제작하여 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 DNA 이중가닥 파손이 일어나도록 함. DNA 이중가닥 파손이 일어난 부위에서 상동성 유전자 재조합 (homology directed repair, HDR)에 의해 mCherry reporter cassette이 유전체 내에 삽입 되도록 Donor DNA를 제작함
표 인간 전분화능 Pitx3-mCherry Knock-In (KI) reporter 후보 세포주의 유전체 내에서 Reporter cassette의 삽입을 확인. 5′ Flanking arm부터 3′ Flanking arm 부위까지 PCR하여 (붉은색 화살표 primer) 유전체의 대립유전자 모두에 삽입된 세포주를 확인함. 대립유전자 모두에 reporter cassette이 삽입되었을 때 약 2.8 kb의 PCR 생성물만 확인됨
표 인간 전분화능 Pitx3-mCherry Knock-In (KI) reporter 후보 세포주에서 인간 전분화능 줄기세포의 특성을 확인. 확립한 Pitx3-mCherry Knock-In (KI) reporter 후보 세포주에서 인간 전분화능 줄기세포 특이적 마커의 발현을 단백질 수준 (A)과 RNA 수준 (B)에서 확인하였으며, 이 세포주의 핵형이 정상임을 확인함 (C)
표 인간 전분화능 Pitx3-mCherry Knock-In (KI) reporter 후보 세포주의 내생성 Pitx3 발현과 mCherry 발현 확인. 기 확립한 Pitx3-mCherry Knock-In (KI) reporter 세포주의 도파민 신경세포 분화법을 이용하여 유도분화과정 중 도파민 신경세포 단계 (분화 40일)에서 mCherry의 발현을 확인하였음 (A). 이 reporter 세포주의 분화 진행과정 중의 PITX3의 발현은 도파민 신경세포 단계까지 계속해서 증가함을 RNA 수준에서 확인하였으며, 이때 mCherry의 발현도 PITX3 발현의 경향과 유사하게 증가하였음 (B). mCherry의 발현으로 PITX3의 발현을 추적할 수 있음을 확인하였으며, 이 단계에서 mCherry를 발현하는 세포는 도파민 신경세포의 위치 특이적 마커인 FOXA2, EN1, LMX1A를 발현하는 세포임을 확인함 (C)
표 중뇌 도파민 신경세포 단계에서 mCherry 양성 세포의 분리. 확립한 Pitx3-mCherry Knock-In (KI) reporter 세포주를 중뇌 도파민 신경세포로 유도분화하였고, 전체 세포 중 약 16%가 mCherry 양성으로 확인됨. 이 단계에서 형광활성화 세포분류기를 이용한 세포 분리를 시도함
표 중뇌 도파민 신경세포 단계에서 신경세포 마커 및 도파민 신경세포 마커 발현의 확인. PITX3 양성 세포 그룹에서 도파민 신경세포의 축적이 확인되었음
표 세포 증식이 일어나는 중뇌 흑질부 (A9부위) 도파민 전구세포 단계에서 LMX1A의 발현 여부에 따라 세포를 분리하고, 세포 증식이 더 이상 일어나지 않는 성숙한 중뇌 도파민 신경세포 단계에서 PITX3의 발현 여부에 따라 세포를 분리함. 분리한 세포 그룹을 전사체 분석을 통하여 분자적 특성을 파악함
표 중뇌 도파민 전구세포 단계에서 LMX1A 음성세포에 대하여 LMX1A 양성세포에서 발현이 증가되어 있는 유전자와 중뇌 도파민 신경세포 단계에서 PITX3 음성세포에 대하여 PITX3 양성세포에서 발현이 증가되어 있는 유전자를 비교분석함으로써 중뇌 흑질부 (A9부위) 도파민 신경세포와 관련된 유전자 발굴을 모색
표 개발한 중뇌 도파민 전구세포 특이적 마커를 이용하여 MACS 방법을 통해 중뇌 도파민 전구세포 단계에서 세포분리를 진행함
표 새롭게 개발한 중뇌 도파민 전구세포 특이적 마커를 이용하여 MACS 방법을 통해 세포분리를 진행하고 그 세포의 특성분석을 진행함. 중뇌 도파민 전구세포 마커인 FOXA2와 LMX1A를 동시에 발현하는 세포의 비율이 세포분리 이후에 증가하는 것을 확인함
표 Pitx3-mCherry KI reporter 세포주로부터 분화시킨 중뇌 도파민 전구세포 단계에서 본 연구에서 개발한 중뇌 도파민 전구세포 특이적 마커를 이용하여 MACS 방법을 통해 세포를 분리한 후, 마커 양성인 세포에서 분화를 진행함. 세포표면마커 Candidate 1 (A)와 Candidate 2 (T) 양성인 세포에서 분화를 진행한 경우, 대조군 (Unsorted)에 비해 성숙한 도파민 신경세포 마커인 TH와 Pitx3 (mCherry)의 발현이 증가하는 양상을 단백질 수준에서 확인함
표 파킨슨병 동물모델에 이식할 세포 단계를 확립을 위한 연구를 진행함. 세포 이식을 위한 첫 번째 과정인 효소에 의한 단일세포 분리 (enzymatic dissociation) 과정에서 도파민 전구세포와 도파민 신경세포에 주어지는 스트레스에 각 세포의 저항성이 다르게 나타나는 것을 확인함. 도파민 전구세포 단계 (분화 20일)에서는 효소에 의한 단일세포 분리 과정 중 사멸하는 세포는 전체 중 약 5%로 확인되었으나, 도파민 신경세포 단계 (분화 40일) 에서는 이 과정동안 전체 중 약 18%의 세포가 사멸함
표 중뇌 도파민 전구세포인 LMX1A 양성세포 이식 16주 후의 생존하는 이식편 (graft)의 크기를 확인할 수 있음 (A). 중뇌 도파민 신경세포인 PITX3 양성세포 이식 16주 후의 생존하는 이식편 (graft)의 크기를 LMX1A 양성세포 이식 후 조직 크기와 비교할 수 있음 (B). LMX1A 양성세포 이식 조직에서 인간세포 마커인 HNA 양성인 세포가 TH를 발현하는 성숙한 도파민 신경세포로 분화하였음을 확인함 (C). 이식한 LMX1A 양성세포 (EGFP 양성세포)가 TH를 발현하는 성숙한 도파민 신경세포로 분화하였음을 확인함 (D). PITX3 양성세포 이식 조직에서 인간세포 마커인 HNA 양성인 세포가 TH를 발현하는 성숙한 도파민 세포임을 확인함 (E). 이식한 PITX3 양성 이식세포 (mCherry 양성세포)가 TH를 발현하는 성숙한 도파민 신경세포임을 확인함 (F)
표 코리더 행동분석 실험법의 확립 (Corridor test). 그림과 같이 간격을 두어 슈가 펠릿 (45 mg)을 통에 담아 왼쪽/오른쪽 어느 쪽을 섭취하는지를 5분 동안 확인함. 6-OHDA 손상 파킨슨 랫트 모델은 오른손을 좀 더 자유롭게 쓰게 되는데 실험을 진행하면 오른쪽에 둔 펠릿에 접근이 왼쪽보다 증가함. 자가행동분석 실험은 약물 유도 행동분석 실험법과는 달리 약물에 노출되지 않은 상황에서의 행동변화를 관찰할 수 있음. 하지만 현재의 6-OHDA 손상 파킨슨 랫트 모델을 평가하는 자가행동분석 실험들의 단점은 반복적으로 실험이 진행되면 랫트가 학습하게 됨으로써 행동을 멈추게 되어 행동변화의 유의성의 정확도가 떨어지게 되므로 암페타민 유도 회전운동 실험법의 보조적 실험으로 사용하는 경우가 많았음. 코리더 실험법은 슈가 펠릿이라는 보상을 도입해서 쥐에게 행동해야 하는 이유를 주기 때문에 기존의 자가행동분석 실험의 단점을 보완한 실험임
표 중뇌 특이적 도파민 신경세포를 랫트 파킨슨병 모델에 이식하였을 시 행동검사를 통하여 운동기능이 회복됨을 확인 (A) Amphetamine 에 의해 유도된 로테이션 테스트 (B) ipsilateral paw 의 사용에 대한 실린더 테스트 결과
표 MPTP를 5일간 투여하여 확립한 마모셋 영장류 파킨슨병 모델에 유도분화한 중뇌 도파민 전구세포를 선조체에 이식 후 행동 개선을 확인함. 세포 이식 후 마모셋 모델에서 나타났던 사지강직, 과도한 눈 깜빡임 등의 증상이 완화되는 것을 확인함
표 영상진단학적 평가를 위해 dopamine transporter (DAT)와 관련된 동위원소 추적자인 18F-FP-CIT를 투여하여 PET 영상을 확인함
표 영상진단학적 평가를 위해 dopamine transporter (DAT)와 관련된 동위원소 추적자인 18F-FP-CIT를 투여하여 PET 영상을 획득 후 분석함. 촬영 시점별로 모델군과 효능군 사이를 비교하였을 때 세포 이식 후 18주부터 유의한 차이가 확인됨
표 인간 전분화능 줄기세포로부터 신경전구세포로의 공통적용 분화법을 (위) 기반으로 분화한 신경전구세포의 이질 혼합성을 파악하고 그의 원인 중 하나인 신경능선세포의 존재를 관찰하였음 (아래)
표 발생과정 중 신경외배엽을 구성하는 신경전구세포를 세포표면 단백질인 PSA-NCAM을 표적으로 하여 분리시 양성세포는 신경전구세포의 형태를, 음성세포는 신경능선세포 형태를 보였으며 (왼쪽) 그것을 수치화하였음 (오른쪽)
표 PSA-NCAM 음성세포에서 신경능선세포의 특징을 확인하기 위하여 신경능선세포의 전형적인 마커인 p75, Hnk1, 그리고 AP2의 발현을 확인하고, 전구세포의 특징인 증식 능력을 Ki67로 관찰하였으며, 또한 미분화 세포의 존재의 확인을 위해 SSEA4 발현 여부를 확인하였으나 발현하지 않음을 확인
표 신경능선세포는 다분화능을 나타냄. PSA-NCAM 음성세포에서 신경능선세포로서 갖추어야 할 다분화능을 증명하기 위하여, 간엽세포로 분화를 유도하였음. FBS를 이용하여 자발적인 분화를 촉진하였고, 4일째 PSA-NCAM 음성세포에서 형태학적 변화를 관찰할 수 있었음 (a). 분화 14일째에는 간엽세포의 형태를 보이고 있었으며 (b), 신경능선 세포의 특성을 잃고, 간엽세포의 마커를 발현하는 것을 유세포분석을 통하여 증명하였음
표 신경능선세포는 간엽세포 유래 골세포, 연골세포, 지방세포, 그리고 평활근세포로 분화가 가능하며, 또한 말초신경세포로도 분화하는 다분화능을 갖고 있음 (a). 따라서 PSA-NCAM 음성세포 유래 간엽세포에서 연골세포 (b), 골세포 (c), 지방세포 (d), 그리고 평활근세포 (j, k)로 분화를 유도함. 추가적으로, PSA-NCAM 음성세포를 유도분화하여 신경전구세포의 성질을 잃게 하고 (h), 성숙한 말초신경세포로 분화를 하였음 (i)
표 PSA-NCAM 음성세포의 신경능선세포로서의 특징이 인간 배아줄기세포 유래 신경능선세포만의 특징이 아니라 역분화 줄기세포, 즉 다른 전분화능 줄기세포에서도 PSA-NCAM 음성세포가 신경능선세포임을 증명하였음. 유세포분석을 통하여 신경능선세포의 마커를 확인하였고 (a), 또한 간엽세포로의 분화가 가능한지의 여부를 유도분화 후 간엽세포의 마커로 확인하였음 (b). 추가적으로, 간엽세포에서 평활근세포로 유도분화하여 역분화 줄기세포 유래 PSA-NCAM 음성세포의 다분화능을 증명하였음
표 신경능선세포는 다분화능의 특징을 갖고 있어 중간엽세포로 분화가 가능함. PSA-NCAM 음성세포와 p75/HNK1 양성세포가 신경능선세포로서 갖추어야 할 간엽세포로의 분화능력을 비교하였음. 10% FBS에 노출된 두 종류의 세포에서 중간엽세포 마커를 대상으로 real-time PCR을 실시하여 두 세포간의 동일한 분화능을 증명하였음
표 인간 전분화능 줄기세포로부터 신경전구세포로의 분화 과정 중 발생할 수 있는 신경능선세포를 분리하여 제거함으로써 이식 시 안전한 세포를 확보하였음. 이러한 세포를 척수손상 (spinal cord injury, SCI)에 적용하기 위한 상업적 비임상 연구에 진입함
표 척수손상 동물모델에 세포를 이식 후 나타난 운동기능의 회복. 척수손상 동물모델에서 세포 이식을 통한 운동기능의 변화추이를 살펴보기 위하여 척수손상 동물모델 제작 1주 후 PSA-NCAM 양성세포를 이식하여 10주까지 BBB (Basso, Beatie, Bresnahan) test로 운동기능의 회복을 확인함. 세포를 이식한 그룹의 경우, 대조군 (control)에 비해 운동기능의 개선을 보였고 (BBB score 증가), 이식 후 4주부터는 control에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 보임 (*, p<0.05). T.P., Transplantation of cells
표 인간 전분화능 줄기세포로부터 희소돌기아교 전구세포로의 분화. 신경 로제트 단계인 분화 10일부터 A2B5 양성세포가 관찰됨 (A). 유세포분석법을 이용하여 A2B5 양성세포 집단을 확인 (B, 진한 파란선은 A2B5 양성세포 분리 전, 연한 파란선은 세포 분리 후). PSI 배양액에서의 희소돌기아교 전구세포의 형태를 확인함 (D-E). PSI 배양액에서 배양 후 희소돌기아교 전구세포의 마커 발현을 확인함 (G-I)
표 척수손상 동물모델에 희소돌기아교 전구세포의 이식 후 뒷다리 운동기능의 회복. 척수손상 동물모델에 희소돌기아교 전구세포를 이식하고 양쪽 뒷다리의 BBB score를 확인함. 대조군에 비해 세포를 이식한 그룹에서 운동기능의 회복을 확인함 (A). 대조군과 세포 이식 그룹에서 Myoelectric motor-evoked potentials (mMEPs)을 확인함 (B)

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전분화능 줄기세포로부터 중뇌 흑질부 특이적 도파민 신경세포의 효율적 분화법 개발을 통한 신경계 질환 세포치료 원천기술 개발 원문보기

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