초록 ▼

ㅇ 연구의 목적 및 내용
I. 연구개발의 목적 및 필요성
올리고당은 기능성 식품으로서의 수요가 늘어날 것으로 예측됨에 따라 고부가가치의 기능성 올리고당 생산의 지속적인 요구가 이루어지고 있다. 모유(human milk)에 포함되어 있는 기능성 올리고당은 모유 내에 약 7-12g/L정도로 존재하며 질병의 예방 및 완화에 주요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 이 기능성 올리고당은 세균과 바이러스에 대항하는 신약으로서의 개발 가능성이 높으며, 모유 올리고당의 하나인 퓨코올리고당의 경우 뇌의 지능 발달, 기억력 향상, 면

ㅇ 연구의 목적 및 내용
I. 연구개발의 목적 및 필요성
올리고당은 기능성 식품으로서의 수요가 늘어날 것으로 예측됨에 따라 고부가가치의 기능성 올리고당 생산의 지속적인 요구가 이루어지고 있다. 모유(human milk)에 포함되어 있는 기능성 올리고당은 모유 내에 약 7-12g/L정도로 존재하며 질병의 예방 및 완화에 주요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 이 기능성 올리고당은 세균과 바이러스에 대항하는 신약으로서의 개발 가능성이 높으며, 모유 올리고당의 하나인 퓨코올리고당의 경우 뇌의 지능 발달, 기억력 향상, 면역반응 조절 및 프리바이오틱스로서의 연구결과가 밝혀졌다. 따라서 퓨코올리고당을 효소공정에 의한 복합반응 방법으로 대량생산하고 이들로부터 유도되는 다양한 신규 기능성 올리고당의 합성 기술 확보를 통해 부가가치 창출이 가능할 것으로 사료된다.
II. 연구개발의 내용
● 단백질의 3D 구조 분석을 바탕으로 한 하이브리드 접근 방버과 초고속 스크리닝 기법을 이용하여 푸코올리고당의 생산에 관여하는 전이효소의 발현, 용해도, 기질 특이성 및 반응성을 향상 시킨다.
● 개량된 변이 효소를 사용하여 대장균 내 올리고당의 생산 경로를 구축하고 대사 공학적 접근을 통해 생산량을 극대화 시키며, 다양한 올리고당을 경제적으로 대량 생산할 수 있는 플랫폼을 구축한다.

ㅇ 연구개발성과
● 퓨코당 전이효소(FT)의 변이주개발: 3FT의 용해도를 증가시키기 위해 alpha-helices를 포함하고 있는 C말단을 제거하여 야생주에 비하여 활성이 높아진 변이주를 발견하였음.
● 코돈 최적화와, 발현 온도, IPTG 농도, 배지 조성의 최적화 과정을 거쳐 3FT 대장균 내 발현에 가장 최적화된 조건을 찾음.
● 단백질의 3차원 구조를 이용한 하이브리드 접근 및 hot spot wizard를 통해 변이 가능한 key residues를 선정 후 포화변이를 수행하였고, 약 3배정도 활성이 늘어난 변이주를 선별함.
● Iterative saturation mutagenesis 및 combinatorial mutagenesis를 수행하여 최종적으로 15.2배 활성이 증가된 변이주를 개발함.
● 2‘FT의 코돈 최적화 및 퓨전 단백질, PGK 또는 SKIK tag를 N-terminal에 연결하는 작업을 통해 단백질의 용해도가 대폭 증가함.
● 퓨코락토올리고당(2-FL) 생산 숙주 개발: 기질인 GDP-fucose를 원활히 생산하기 위해 기질인 L-fucose와 D-lactose를 분해하는 유전자를 제거하고 fkp 유전자를 클로닝하여 과발현시켜 대장균 내에서 Salvage pathway 생산 경로를 구축하였고, 초기 110mg/l의 3FL이 생산되는 것을 확인함.
● Yeast extract의 농도 조절, GSK의 과발현을 통한 GTP pool 증가, 생산균주 교체 및 lactose uptake율 증가를 위한 M15균주 제작을 통해 약 4.6g/L의 3FL을 생산함.
● 2’FL의 대장균 내 De Novo 생산 경로를 구축하기 위해 관련 유전자를 클로닝하여 3FL 생산실험 시 제작한 균주(△M15)에서 생산실험 결과 △lacZ균주와 비교하여 2‘FL 생산량이 약 6.4배 증가함.
● 대장균의 lac operon을 engineering하여 lacY의 발현 저해 없이 glucose를 feeding할 수 있는 균주를 구축하였고, glycerol feeding보다 2’FL 생산시 약 1.2배 생산이 증가

ㅇ 연구개발성과의 활용계획 (기대효과)
푸코올리고당은 최근 프리바이오틱스 (prebiotics)의 기능 및 병원성 균주의 초기 감염 과 정에서의 숙주세포의 장내 부착을 막는 저해제로서 연구가 되었으며, 유아식품 및 기타 식-음료품의 기능성 식품 첨가제 또는 의약분야에서의 새로운 개념의 치료제로서 이용될 수 있다.
기술적 측면에서는 탄수화물 및 관련효소 개발 연구에 필요한 생물정보학, 분자진화기법 등의 인프라 기술 발전과 탄수화물 관련 효소에 대한 초고속 스크리닝 시스템의 구축 및 푸코올리고당의 대량생산을 통한 의학, 약학, 생명공학 등 다양한 분야 연구에 활용을 기대한다. 경제적·산업적 측면에서는 대량 생산되는 올리고당을 통한 관련 산업에서 다양한 제품군 개발로 인한 수익창출과 양국 협력에 의한 바이오공학 산업의 활력주도 및 바이오제품 대량생산 기틀을 확보할 수 있을 것이다.


(출처 : 요약문 4p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 요약문 ... 4
• 목차 ... 5
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
• 가. 연구 개발의 필요성 및 최종 목적 ... 6
• 나. 연구 개발의 목표 및 내용 ... 6
• 2. 연구수행내용 및 성과 ... 11
• 가. 1차년도 연구 개발 내용 ... 11
• 나. 2차년도 연구 개발 내용 ... 15
• 다. 3차년도 연구 개발 내용 ... 23
• 3. 목표 달성도 및 관련 분야 기여도 ... 27
• 가. 목표 및 목표 달성여부 ... 27
• 나. 연구개발성과의 활용 계획 등 ... 28
• 붙임. 참고문헌 ... 29
• 끝페이지 ... 30