초록 ▼

4. 당해년도 연구결과 요약

O 유선종양 형성 소동물 적용을 위한 엑소좀 준비
- 반려동물 면역세포 유래 엑소좀 분리 및 특성 분석
o 개 지방조직 유래 성체줄기세포 배양
o 개 말초혈액 단핵세포(PBMCs) 유래 자연살해세포(NK세포) 배양
※ MACS 시스템에서 특정 항체 이용 CD5(-) 세포 분리 및 FACS 확인
o 개 NK세포 활성 유도 : CD5(-)세포에 IL-2, IL-15, IL-21 첨가 및 NK세포 활성 확인
※ 활성화된 NK세포 특이마커 확인 (NKp30,

4. 당해년도 연구결과 요약

O 유선종양 형성 소동물 적용을 위한 엑소좀 준비
- 반려동물 면역세포 유래 엑소좀 분리 및 특성 분석
o 개 지방조직 유래 성체줄기세포 배양
o 개 말초혈액 단핵세포(PBMCs) 유래 자연살해세포(NK세포) 배양
※ MACS 시스템에서 특정 항체 이용 CD5(-) 세포 분리 및 FACS 확인
o 개 NK세포 활성 유도 : CD5(-)세포에 IL-2, IL-15, IL-21 첨가 및 NK세포 활성 확인
※ 활성화된 NK세포 특이마커 확인 (NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, CD244, perforin, granzyme B 등)
o 다양한 엑소좀 분리방법 이용 및 최종『초고속 원심분리법』선정
※ 배양액 농축 뒤, ExoQuick, molecular weight cut-off, 초고속 원심분리법 등 이용
※ 줄기세포 유래 엑소좀/평균 : 45 ㎍/1x10⁶, NK세포 유래 엑소좀/평균 : 12 ㎍/1x10⁶ 수득
o 초고속 원심분리법을 이용한 엑소좀 분리 및 특성 분석
※ Flotillin-1, CD63, CD81, Alix, HSP70, TSG101 등 엑소좀 특이마커 확인
※ Nanoparticle tracking analysis를 통한 엑소좀 분포도 측정 및 분포도 (40~200 nm) 확인
※ 전자현미경 (TEM) 분석을 통한 엑소좀 사이즈 확인
※ Multiplex analysis를 통한 엑소좀 구성 주요인자 분석 (1 순위 : CD9, 2순위 : CD81로 확인)

O 엑소좀 생산량 제고를 위한 NK세포 대량 증식 기술 확립
- 개 NK세포 대량 증식 조건 확립 및 표적세포 (유선종양세포)에 대한 세포독성 확인
o 감마선 조사한 영양세포(feeder cells) 공배양을 통한 NK세포 대량 증식 조건 확립
※ NK세포와 영양세포 공배양을 통해『활성화된 NK세포』“100배 이상” 증식 확인
o 표적세포에 대한 NK세포 독성(NK-target cell cytotoxicity), 최대 40% 증가 확인
o 표적세포에 대한 NK세포의 IFN-γ 생성(300~500 pg/mL) 확인
※ IFN-γ 생성 : 활성화된 NK세포의 주요 특징

O 소동물 유선종양 형성을 위한 유선종양세포 준비
- 개 유선종양세포 배양 및 특성 분석
o 전이성, 비전이성 유선종양세포(CHMp-5b, CHMp-13α, REM134) 배양
※ 정상 줄기세포에 비해 유선종양세포에서 악성종양 특이마커 (CD133, MDR 등) 발현 증가 확인
- 개 유선종양세포의 스페어 형성(sphere formation) 및 악성종양 특이마커 분석
o 스페어 형성 유선종양세포에서 CD133, Notch1 등 악성종양 관련 인자 발현 증가 확인
※ 종양세포의 스페어 형성 : 암줄기세포의 특성을 증가시키는 방법, 항암제 스크리닝에 널리 이용

O 유선종양세포를 이용한 소동물 유선종양 형성 및 특성 분석
- 스페어 형성 유선종양세포를 이용한 소동물 유선종양 형성
o 전이성, 비전이성 유선종양세포(1x10³ ~ 1x10⁷) 이용, 암컷 누드 마우스 유선종양 형성 유도
o 세포 수에 따른 유선종양 형성능, 종양 크기 등 종양 성장 과정 주간별 관찰
- 유선종양 형성(1x10³) 2주 후, 소동물에 엑소좀 적용 및 항종양 효과 분석
o 유선종양 형성 마우스에 줄기세포, NK세포 유래 엑소좀 적용
※ 유선종양 형성 2주차 마우스에 5주간 주 2회 엑소좀 적용 (IV 적용, 100 ㎍/100 μL)
o 유선종양 형성 마우스에 줄기세포, NK세포 유래 엑소좀의 항종양 효과 분석
※ 엑소좀 투여군 마우스의 몸무게는 정상군과 비슷한 수준으로 유지됨 (±오차있음)
※ 유선종양 형성 8주차, 줄기세포 유래 엑소좀 투여군에서 종양크기 50% 감소 확인 (±오차있음)
※ 유선종양 형성 8주차, NK세포 유래 엑소좀 투여군에서 종양크기 80% 감소 확인 (±오차있음)
o 유선종양 형성 마우스 조직 분리 후 CD133 등 악성종양 관련 인자 분석
※ 유선종양 형성 8주차, 조직 분리 및 종양 형성, 전이 등 관련 인자 분석 (진행 중)

O 유선종양 환축 3두에 줄기세포 유래 엑소좀 적용 및 16주간 추적 관찰 (진행 중)
- 유선종양 환축에 3주 간격으로 총 4회 줄기세포 유래 엑소좀 투여 및 관찰

(출처 : 요약 1p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• I. 연구배경 및 목표 ... 3
• 1. 연구배경 ... 3
• 2. 연구의 최종목표 ... 12
• 3. 연차별 연구개발 목표와 내용 ... 12
• II. 연구방법 및 수행전략 ... 13
• 1. 재 료 ... 13
• 2. 연구전략 및 방법 ... 13
• III. 연구결과 ... 17
• 1. 1차년도 연구결과 요약 ... 17
• 2. 2차년도 연구결과 요약 ... 38
• IV. 연구결과요약 ... 54
• V. 금후 추진계획 ... 54
• VI. 참고자료 ... 55
• 끝페이지 ... 55