초록 ▼

4. 당해년도 연구결과 요약

○ 제1세부과제명: NGS 기법을 활용한 AI 바이러스 진단 플랫폼 구축
1) 조류인플루엔자 바이러스 진단 최적화 NGS 기법 확립
o 국내외 NGS 기법 조사 및 결과 비교 분석을 통해 AI 분석 플랫폼을 확립하고자 하였음. 현재 다수의 국내외 표준 연구기관에서 인플루엔자 바이러스에 대해 NGS를 수행하고 있으며 대부분이 Zhou protocol(2009 논문)을 기반으로 기관별로 최적화하여 적용하고 있음
o 유전자 분석 프로그램 사용 조사 결과, 호주 AAHL는 Gen

4. 당해년도 연구결과 요약

○ 제1세부과제명: NGS 기법을 활용한 AI 바이러스 진단 플랫폼 구축
1) 조류인플루엔자 바이러스 진단 최적화 NGS 기법 확립
o 국내외 NGS 기법 조사 및 결과 비교 분석을 통해 AI 분석 플랫폼을 확립하고자 하였음. 현재 다수의 국내외 표준 연구기관에서 인플루엔자 바이러스에 대해 NGS를 수행하고 있으며 대부분이 Zhou protocol(2009 논문)을 기반으로 기관별로 최적화하여 적용하고 있음
o 유전자 분석 프로그램 사용 조사 결과, 호주 AAHL는 Geneious v.8 프로그램을 사용하고 있으며, 영국 APHA은 리눅스를 기반으로 내부 전산시스템을 구축하고 있음. 일본 NIAH는 CLC Genomics Workbench를 사용하고 있으며. 미국 USDA SEPRL은 리눅스 기반으로 오픈 소스인 Galaxy program을 사용하고 있음.
o 사용자 편의와 일관된 workflow를 구축하고자 GUI(그래픽 작업 인터페이스)를 제공하는 CLC Genomics Workbench 프로그램을 설치하고 분석프로그램으로 활용함
o 구축된 플랫폼 과정에 대해 바이러스 양성 임상 시료와 해당 시료의 분리주에 대한 비교 실험을 실시한 결과, amplicon을 이용한 targeted sequencing의 경우, 고동도의 바이러스가 포함된 요막강액(분리주) 뿐만 아니라 qRT-PCR에서 검출한계 내의 농도인(Ct값 24.5 ~33.6) 야외시료에서도 모두 Full gene 유전자를 확보할 수 있었음.
o 구축된 AI NGS 플랫폼으로 장비를 30회(샘플 1천점 이상) 구동하여 유전자 정보들을 대량생산 및 확보하였으며, 대량의 유전자 분석에 활용하고 있음
2) NGS 적용 AI 진단 시료에 대한 전처리 과정 최적화
o NGS 분석을 위해 단계별 과정(RNA 추출, PCR, 라이브러리 제작 등)에 대한 절차도를 작성 하고 보유 기기인 Illumina Miseq 장비를 이용하여 플랫폼을 구축하고자 AI 분리주에 대해 Target sequencing 실험을 수행
- 표준주를 이용하여 RNA 추출 비교 실험을 실시하고, multi-segment PCR 실험시 시료의 rRT-PCR CT값이 33~35 수준까지 증폭됨을 확인함. Illumina DNA Flex kit를 사용하여 Library prep 단계를 진행하였으며. 각 단계별 세부 조건들에 대해 최적 조건을 확립함
- Library 제작 단계의 자동화 장비 도입 및 셋팅을 완료하여 인력 투입 및 교차 오염 최소화 하여 실험의 효율성을 개선시켰으며 유전자 확보량 비교실험 결과, 수작업 결과에 비해 동등 이상임을 확인함.
- 임상시료에 대한 Targeted 시퀀싱 평가 결과, 분변의 경우 최소 검출 한계 이상의 농도(CT 값)에서 average coverage 1000X 이상의 depth를 확인하였고 전장 유전체 유전자 정보가 분리바이러스와 비교시 100% 일치하였음. whole genome 시퀀싱의 경우, 낮은 depth로 mapping 되는 read는 적었지만 mapped read에서 AIV 유전자가 52~95% 정도 확인되어 차년도에 효율성을 개선할 예정임

○ 제2세부과제명: NGS 시스템에 의한 유전자 정보 생산 및 분석 시스템 구축
- 목표: AI 유전자 정보 생산 및 정보 처리 시스템(Pipeline) 구축
1) AI 전장 유전자 생산 자료에 대한 정확도 검증 및 데이터 분석
o AI 바이러스 8주에 대해 NGS 결과를 분석 시 회당 약 100만~470만 cluster의 약 149 bp의 read가 생산되며, 대부분의 생산된 데이터 중 96% 이상의 데이터가 ≥Q30(Q-score 30, base calling 정확도 99.9%이상)으로 확인되고, average coverage 5000X 적용 범위의 데 이터가 생산됨.
o Targeted sequencing 결과를 분석하기 위해 de novo assembly workflow를 작성하였으며, 데이터의 정확도 검증을 위해 주가로 Reference mapping workflow를 작성하고 실험데이터에 적용 후 세부 parameter를 검토하여 바이러스별, 유전자별 quality contr이를 실시함.
o 바이러스 배양액을 단계희석 후 NGS를 실시한 경우, Reference mapping 분석시 상대적으로 길이가 긴 polymerase 유전자들은 다른 유전자와 비교시 depth가 낮아지는 경향이 있음.
2) AI 바이러스 혈청형 동정 분석 시스템 구축
o Genebank Influenza database 및 GISAID 인플루엔자 염기서열을 주기적 업데이트하여 64만 개 규모의 local DB를 확보하여 활용 중임.
o De novo assembly로 확보된 전장 유전자는 기존 분리주 유전자 Database와 BLAST하여 blast rank가 높게 조회된 유전자에 대하여 Mapping을 실시한 결과로 검체의 유전 정보와 coverage를 확인한 후 기존 분리주들과 유전정보를 비교하여 subtype을 확인함.
o 혈청형 동정 시스템 검증을 위해 AIV 분리주 50주에 대한 NGS 실험을 실시하여 De novo assembly로 확보된 전장 유전자를 기존 BLAST 및 reference mappin을 실시한 결과, 49주는 기존 결과와 동일하였으며 H4형 1주가 H1형 HA 유전자가 검출되어 2종의 subtype이 혼합되어 있음을 확인함. 표준주 선정시 검증 등에 NGS를 지속적으로 활용하고자 함

(출처 : 요약 1p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• I. 연구배경 및 목표 ... 3
• 1. 연구배경 ... 3
• 2. 연구최종목표 ... 4
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 4
• II. 연구방법 및 수행전략 ... 5
• 1. 재 료 ... 5
• 2. 연구전략 및 방법 ... 5
• III. 연구결과 ... 5
• 1. 제1세부과제명: NGS 기법을 활용한 AI 바이러스 진단 플랫폼 구축 ... 5
• 2. 제2세부과제명: NGS 시스템에 의한 유전자 정보 생산 및 분석 시스템 구축 ... 10
• IV. 연구결과요약 ... 14
• V. 금후 추진계획 ... 15
• VI. 참고자료 ... 16
• 끝페이지 ... 17