초록 ▼

5. 최종 연구결과 요약
가. 세부과제명 : 뉴캣슬병 및 감보로병 동시예방을 위한 키메릭 뉴캣슬병바이러스 개발
1) 감염성 NDV 클론벡터 제작
- IBD 예방에 필요한 방어단백질 VP2를 삽입하기 위한 backbone 으로 뉴캣슬병 Lasota strain full genome을 이용하였다.
- Sitedirected mutagenesis 기법을 이용하여 NDV 감염성 클론의 P와 M 단백질 유전자 사이에 제한 효소 site를 만들어 IBDV 의 방어단백질 VP2를 삽입하는 위치를 제작하였다.
- VP2

5. 최종 연구결과 요약
가. 세부과제명 : 뉴캣슬병 및 감보로병 동시예방을 위한 키메릭 뉴캣슬병바이러스 개발
1) 감염성 NDV 클론벡터 제작
- IBD 예방에 필요한 방어단백질 VP2를 삽입하기 위한 backbone 으로 뉴캣슬병 Lasota strain full genome을 이용하였다.
- Sitedirected mutagenesis 기법을 이용하여 NDV 감염성 클론의 P와 M 단백질 유전자 사이에 제한 효소 site를 만들어 IBDV 의 방어단백질 VP2를 삽입하는 위치를 제작하였다.
- VP2를 삽입하고자 하는 위치에 GFP를 삽입하여 단백질 발현여부를 확인하여, 삽입위치 선정 및 단백질 발현에 이상이 없음을 확인하였다.
- 또한 재조합 NDV 바이러스의 F 와 HN 유전자를 장친화성 NDV 분리주(약독주 ND 백신주 바이러스)의 F 와 HN 으로 교체하기 위하여, 장친화성 NDV strain의 F 및 HN ORF 부분을 클로닝하였다.
2) IBDV 방어단백질 클로닝 및 증폭
- 강독형 IBDV 분리주(Kr/LC/2010 strain)의 방어단백질 VP2 ORF 유전자(1,356bp)를 증폭하고 염기서열을 확인하였다.
- VP2 ORF를 발현을 위한 NDV gene end 및 gene start sequence를 포함하는 plasmid를 합성하고 VP2 ORF를 삽입하여 제작하였다.
3) 감염성 NDV 클론 내 IBDV 방어단백질 삽입 및 회수
- Lasota strain 감염성 NDV 클론 내 P 와 M 단백질 유전자 사이의 제한효소 사이트 내VP2 ORF를 포함하는 삽입부분을 삽입하여 Hep2 cell 에 transfection 시켰다.
- Transfection 시킨 Hep2 cell 배양액을 SPF 종란에 접종 시킨 후 배양액을 회수하여 RT-PCR로 확인 결과 ND와 VP2 가 삽입된 것을 확인하였다.
4) 재조합 NDV의 증식성조사
- rLasota-VP2 바이러스를 limit dilution 하여 SPF 종란에 serial passage
- 매 passage 별 HA, IBDV VP2 PCR 등으로 바이러스 확인 및 EID50 측정
- CE10 까지 serial passage 결과 10^7.9 EID₅₀/0.1ml 역가의 바이러스 회수
5) 재조합 NDV의 IBDV 방어단백질 발현여부 조사 및 발현량 측정
- Anti-NP 및 Anti-VP2 항체를 이용하여 발현여부 확인
- Western blotting 결과 VP2 단백질(37kDa) 크기의 밴드 확인
- IFA 결과 anti-NP 및 anti-VP2 혈청에 양성반응
- ND 발현량은 HA 역가 (2^10) 및 EID50로 측정
- VP2 발현량은 anti-VP2 단클론항체(R63)을 이용하여 DAS(double antibody sandwich) ELISA를 실시한 결과 10² EID₅₀/0.1ml 이상의 VP2가 발현된 것으로 확인됨.
6) 재조합 NDV의 실험실적 면역원성 및 방어효능 평가
- 3주령 SPF닭에 재조합 NDV를 바이러스 함량별로 접종 (10⁶ EID₅₀/dose, 10⁷ EID₅₀/dose, 점안) 한 뒤 2주 및 3주째 채혈하여 혈청역가 확인결과 ND HI titer는 양성인데 비해 IBDV ELISA 및 AGP 결과 음성임을 확인
- 3주령 SPF 닭에 재조합 NDV를 ISA70 oil과 3:7 비율로 혼합하여 근육접종한 후 3주째에 채혈하여 혈청역가 확인결과 ND HI titer는 양성인데 비해 IBDV ELISA 및 AGP 결과 음성임을 확인

(출처 : 5. 최종 연구결과 요약 1p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 3
• 1. 연구배경 ... 3
• 2. 연구최종목표 ... 4
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 4
• Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 4
• 1. 재 료 ... 4
• 2. 연구전략 및 방법 ... 5
• Ⅲ. 연구결과 ... 5
• IV. 연구결과 요약 ... 11
• Ⅴ. 고 찰 ... 12
• Ⅵ. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 13
• Ⅶ. 연구사업 추진상 문제점 및 건의사항 ... 14
• Ⅷ. 주요연구과제 변경사항 ... 14
• IX. 참고자료 ... 14
• 끝페이지 ... 16