초록 ▼

■ 연구개발사업의 목적: 본 연구는 차세대 유전체 해독기술(NGS: next generation sequencing)에 의해 삼중음성유방암에서 특이적으로 발현이 증가된 것으로 동정된 A20와 BAG2 단백질이, 삼중음성유방암의 암전이 및 암형성에 관여하는 분자적 기전 및 임상적 연관성을 규명하고, 이를 기반으로 삼중음성유방암 환자의 혈액을 이용한 유방암 진단키트 개발 가능성과 이의 임상적 타당성을 검증하고자 하였음.

■ 연구방법 및 결과: 과제 선정 시의 선행연구 결과에 기반하여 1세부와 2세부의 협업을 통하여 제시된

■ 연구개발사업의 목적: 본 연구는 차세대 유전체 해독기술(NGS: next generation sequencing)에 의해 삼중음성유방암에서 특이적으로 발현이 증가된 것으로 동정된 A20와 BAG2 단백질이, 삼중음성유방암의 암전이 및 암형성에 관여하는 분자적 기전 및 임상적 연관성을 규명하고, 이를 기반으로 삼중음성유방암 환자의 혈액을 이용한 유방암 진단키트 개발 가능성과 이의 임상적 타당성을 검증하고자 하였음.

■ 연구방법 및 결과: 과제 선정 시의 선행연구 결과에 기반하여 1세부와 2세부의 협업을 통하여 제시된 연구를 수행하였고 다음과 같은 결과를 도출하였음.
○ 차세대 유전체 해독 기술에 의해 도출된 BAG2 유전자의 삼중음성 유방암의 암형성과 전이기전에 대한 분자적 기전 규명
-Co-chaperone으로 알려진 BAG2 단백질이 Cathepsin B 단백질의 암유발단백질(oncogneic protein)로서의 기능을 매개하는데 결정적인 역할을 담당함으로서 삼중음성 유방암의 암형성과 암전이에 관여함을 최초로 규명하여 2017년 12월 Cell Reports(게재 당시 IF;8.282)에 논문을 게재하였음.
-유방암 아형에 따른 세포주들에서의 BAG2 발현 분석과 TCGA 유방암 환자 빅테이터 분석, 강남세브란스 병원의 유방암 환자의 데이터 분석을 통해 BAG2 유전자가 삼중음성유방암 환자에서 과발현되어 있으며 유방암 환자의 재발 및 원격 전이 그리고 낮은 생존률과 연관되어 있음을 규명함.
-BAG2 유전자가 knockdown된 삼증음성유방암 세포주를 이용한 동소이식 및 이종이식 동물모델에서 폐전이 및 암형성이 감소됨을 확인하였음.
-2D-gel electrophoresis를 이용한 proteomic analysis에 의해 BAG2 단백질의 타겟이 Cathepsin B 단백질임을 규명하였고 BAG2와 Cathepsin B 단백질의 상호작용을 검증하였음.
-BAG2 유전자가 knockdown된 경우 Cathepsin B의 mature form이 세포 내에서 증가함으로 인해 암형성과 폐전이가 감소하는 반면, BAG2가 과발현된 경우 pro-Cathepsin B의 autocleavage가 억제되며 pro-Cathepsin B의 세포외 분비를 증가시킴으로서 암전이가 촉진됨을 규명하였음.
-BAG2 단백질은 trans-Golgi network을 통해 pro-Cathepsin B의 분비를 조절함을 규명함.

○ 유방암 환자의 혈액으로 분비되는 BAG2 단백질의 유방암 진단 마커로서의 가능성 분석과 Sandwich ELISA용 단일클론 항체 개발: 유방암 진단키트 개발 가능성 탐색
-BAG2 단백질이 전이성 유방암 세포의 세포외로 분비됨을 최초로 발견하였으며, 또한 정상 혈청에서 보다 유방암 환자의 혈청에서 BAG2 단백질의 발현이 증가되어 있음을 확인하였음.
-유방암 환자의 혈청으로 분비된 BAG2 단백질을 탐지하기 위한 단일클론 항체를 제작하였고, sandwich ELISA 기반 진단키트에 사용될 최적의 matched monoclonal antibody pair를 최종 확보하였음(2019년 국내 특허 출원: 10-2019-0016347호)
-sandwich ELISA 기반 matched BAG2 antibody pair를 이용하여 정상인의 혈액과 암환자 100명의 혈액에서 BAG2 발현을 분석한 결과 유방암 환자의 혈액에서 BGA2 단백질이 유의미하게 발현이 증가됨을 확인함으로서 BAG2 기반 유방암 진단 키트 개발의 원천 기술을 확보하였음.

○ 차세대 유전체 해독 기술에 의해 도출된 A20(TNFAIP3) 유전자의 TGF-β 매개 EMT 기전규명을 통한 삼중음성 유방암의 암전이 기전 규명
-면역조절인자로 알려진 유비퀴틴 편집효소 A20 단백질이 삼중음성유방암의 암전이를 매개함을 최초로 규명하여 2017년 10월 Nature Cell Biology(게재 당시 IF:20.06)에 논문을 게재하였음.
-A20 유전자가 과발현된 경우 TGF-β 매개 상피중간엽전이(EMT) 현상을 매개하는 Snail1 유전자의 mRNA 발현에는 영향을 미치지 않는 반면 Snail1 단백질의 안정성을 증가시킴으로서 EMT 현상의 유도에 관여함을 증명하였음.
-A20 단백질의 유비퀴틴화 활성이 Snail1 단백질의 3개의 리신 아미노산을 모노유비퀴틴화 시킴으로서 GSK3β에 의한 Snail1의 인산화가 감소하며 이를 통해 Snail1의 안정성이 증가됨을 규명하였음.
-A20 knockdown 및 A20에 의해 유비퀴틴화 되는 lysine 잔기를 arginine으로 돌연변이 시킨 Snail1-3KR mutant의 경우 이종 이식 및 동소이식 동물모델에서 폐로의 암전이가 감소함을 증명하였음.
-A20 유전자 발현이 knockdown된 경우 암줄기세포능의 감소와 항암제 저항성이 감소됨을 확인하였음.
-염증성 사이토카인인 TNFα에 의한 EMT 현상에 A20 유전자가 관여됨을 증명하였음.
-유방암 아형에 따른 세포주들에서의 A20의 발현 분석과 TCGA의 유방암 환자 빅데이터 분석, 강남세브란스 병원의 유방암 환자의 데이터 분석을 통해 A20가 삼중음성 유방암 환자에게서 유의미하게 발현이 증가되며 A20의 과발현시 유방암환자의 생존률이 감소됨을 확인하였음.

○ 유방암 환자에서 BAG2와 A20 발현에 따른 임상 특징 및 예후 분석
-유방암 환자에서 A20 및 BAG2의 발현이 높을수록 나쁜 예후 인자들 (예, 호르몬 수용체 음성, 삼중음성 유방암, 높은 병기)과 관련 있는 것으로 나타났으며, 또한 실제로 생존율이 낮은 것을 확인하였음.
-또한, A20 및 BAG2 모두 유방암 환자의 재발 및 전체 생존율과 통계적으로 의미있게 연관 있는 독립적인 예후인자임을 확인함. 즉 A20와 BAG2의 발현 증가는 유방암 환자의 poor prognostic marker로 활용될 수 있음을 증명하였고, 기존의 임상병리학적 요인만으로 구성된 생존 예측 모델에 A20 및 BAG2를 추가였을 때, 더 뛰어난 생존 예측 모델을 구축할 수 있었음.
-유방암 세포주, TCGA public data, 유방암 환자 데이터에서 A20 및 BAG2의 발현을 유방암 아형별로 분석하였으며, BAG2의 경우 예후가 나쁜 삼중음성유방암에서 발현이 특히 높았음.
-삼중음성유방암 환자 200례에서 microarray 기반으로 6가지 아형으로 분류했을 때, LAR type에서 A20의 발현이 높은 것을 확인하였고, 이는 추후 삼중음성유방암의 아형 분류 및 표적 치료 개발에 기반이 될 것으로 생각됨.
-BAG2 기반의 유방암 진단키트 개발을 위한 임상적 근거를 구축하기 위해, 100명의 유방암 환자 및 정상인을 전향적으로 모집하여 혈액 내 BAG2 level을 ELISA로 평가하였을 때, 정상인에 비해 유방암 환자에서 BAG2 level이 통계적으로 유의미하게 높은 것을 확인함.
-유방암 환자에서 혈액 내 BAG2 level이 높을수록 Stage가 높은 것을 확인하였고, 이러한 BAG2 level이 치료 반응 및 혈중순환암세포(circulating tumor cells: CTC)와 관련이 있는 것으로 확인됨.

■ 기대효과
○ 삼중음성 유방암의 암화기전에 관련된 새로운 신규타겟 단백질들의 분자적 작용기전(BAG2에 의한 Cathepsin B 조절 기전 및 A20에 의한 Snail1 전사인자의 조절 기전)을 규명함으로서, 삼중음성 유방암의 암형성 및 암전이와 관련하여 새로운 기전을 제시하였음.. 또한 삼중음성유방암의 치료제 개발을 위한 새로운 타겟으로서 BAG2-Cathepsin B, A20-Snail1의 단백질 상호작용을 제안함으로서 향후 혁신적인 삼중음성 치료제 개발의 토대가 될 것으로 사료됨.
○ 삼중음성 유방암 환자의 혈액을 이용한 혈중 진단키트 개발의 원천 기술을 확보함으로서 국내외 기업과의 공동 연구 또는 기술이전으로 부가가치를 창출할 것으로 사료됨.
○ 본 연구 과제에서 확인한 유방암의 병인과 관련된 BAG2 및 A20의 분자 기전을 유방암 환자데이터를 통해 그 의미를 확인함으로써, 유방암 예후 바이오마커로서 BAG2 및 A20 유전자가 임상적으로 유용하게 사용될 것으로 사료됨.

(출처 : 요약문 5p)

Abstract ▼

■ Research objectives: The goal of this project is to elucidate molecular mechanisms of tumorigenesis and metastasis of triple negative breast cancers regulated by ubiquitin editing enzyme A20 and co-chaperone BAG2 proteins, respectively, which have been identified to be specifically overexpressed i

■ Research objectives: The goal of this project is to elucidate molecular mechanisms of tumorigenesis and metastasis of triple negative breast cancers regulated by ubiquitin editing enzyme A20 and co-chaperone BAG2 proteins, respectively, which have been identified to be specifically overexpressed in TNBC by next generation sequencing (NGS), and explore their clinical significance in TNBC patients. In addition, we verify the possibility to develop the diagnosis kit of breast cancers through detecting the secreted BAG2 protein in blood samples of breast cancer patients and demonstrate its clinical relevance.

■ Experimental methods and Results
◯ Summary of novel mechanism of tumorigenesis and metastasis of TNBC by co-chaperone BAG2 targeting Cathepsin B
-We first demonstrated that co-chaperone BAG2 is a regulator of the dual functions of its client protein, Cathepsin B, facilitating the progression of TNBC and published our results to top-tier journal, Cell Reports (IF; 8.03 in the year 2017), at December, 2017.
-We found that BAG2 is specifically overexpressed in TNBC cells than in luminal subtypes and a significant higher level of BAG2 expression is observed in TNBC patients compared to normal-like, luminal A, luminal B and HER2-enriched patients.
-Breast cancer patients with high BAG2 expression had shorter survival times compared to those with low BAG2 expression and showed significantly increased hazard ratio, indicating that BAG2 is strongly correlated with poor clinical outcomes and may serve as a predictive factor for the risk of mortality in breast cancers.
-BAG2-depleted TNBC cells decreased tumor formation in xenograft mouse model and BAG2-depleted 4T1-Luc cells reduced lung metastasis in orthotopic mouse models, suggesting that BAG2 facilitates tumor growth and lung metastasis in TNBC cells.
-Through 2D-gel electrophoresis and mass spectrometric analysis, we identified the Cathepsin B protein interacting with BAG2 protein and we found that BAG2 depletion suppresses tumorigenesis and lung metastasis and induces cell death by increasing the intracellular mature single-chain Cathepsin B.
-In addition, we showed that BAG2 expression induces metastasis by blocking the auto-cleavage processing of pro-Cathepsin B via interaction with the pro-peptide region and revealed that BAG2 regulates pro-Cathepsin B/annexin II complex formation and facilitates the trafficking of pro-Cathepsin B-containing trans-Golgi network 38 (TGN38)-positive vesicles toward the cell periphery, leading to the secretion of pro-Cathepsin B, which induces metastasis.

◯ Development of monoclonal antibodies for sandwich ELISA to detect the BAG2 protein which is secreted into the blood of breast cancer patients and exploration of the possibility to develop BAG2-specific diagnosis kit for breast cancer patients
-We identified that BAG2 is secreted into the medium from TNBC cells and observed BAG2 expression in the bloods of breast cancer patients, compared to normal volunteers, suggesting that the secreted BAG2 may be used as a biomarker for a diagnosis kit to detect breast cancers.
-We screened the monoclonal antibodies to detect the secreted BAG2 and developed the sandwich ELISA with matched BAG2 antibody pairs (Domestic patent application: 10-2019-0016347)
-Using this sandwich ELISA, we analysed the secreted BAG2 in the bloods of 100 breast cancer patients and confirmed that BAG2 is expressed in the bloods of breast cancer patients with statistical significance, compared to normal volunteers.

◯ Summary of novel mechanism of TNBC metastasis by ubiquitin editing enzyme A20
-We first demonstrated a role of ubiquitin editing enzyme A20 regarding the metastasis of TNBC and published our results to top-tier journal, Nature Cell Biology (IF; 20.06 in the year 2017), at October, 2017,
-A20 did not affect expression of EMT (epithelial-mesenchymal transition) transcription factor Snail1 mRNA, but increased the stability of Snail1 protein. Therefore, we demonstrated that A20 is involved in TGF-β-mediated EMT through stabilization of Snail1.
-We provided evidence that A20 monoubiquitinates three lysine residues of Snail1 and this multi-monoubiquitination of Snail1 by A20 is critical for lung metastasis in 4T1-Luc orthotopic mouse model of breast cancer and xenograft mouse model.
-A20-mediated Snail1 multi-monoubiquitination decreased the interaction of Snail1 with GSK3β, and thus inhibited GSK3β-mediated Snail1 phosphorylation, resulting in the augmentation of Snail1 stability in nucleus.
-A20-depleted M4 and MDA-MB231 breast cancer cells showed that the mammosphere formation and CD44+/CD24- cancer stem cell population are decreased and also revealed the reduced viability following treatment with anti-cancer drugs, suggesting that A20 is required for cancer stemness and chemoresistance of breast cancer cells.
-Snail1 expression in A20 KO MEF and A20-depleted HS578T cells upon TNFα treatment revealed that A20 is also involved in TNFα-mediated Snail1 stabilization and inflammation-induced EMT.
-Analysis of TCGA database and other public microarray data indicated that A20 is significantly upregulated in tumor samples of basal-like subtypes including TNBC.
-Analysis of breast cancer tissue microarray from Gangman Severance Hospital demonstrated an association of high A20 expression with distant metastasis-free, overall, and breast cancer-specific survival and verified that A20 can be used as a poor prognostic maker for breast cancer patients.

◯ Evaluation of clinical features of breast cancer patients with high BAG2 or A20 expression
-Either high A20 or BAG2 expression in breast cancer patients was significantly associated with poor prognostic factors such as hormone receptors negative, TNBC, and advanced tumor stages and patients with high A20 or BAG2 expression showed poor recurrence-free survival and overall survival. Therefore, we found that high A20 or BAG2 expression is an independent poor prognostic factor for breast cancer.
-When we added A20 or BAG2 expression to base model composed of clinical and pathological factors, more accurate prediction model for survival was established.
-BAG2 expression was profoundly increased in TNBC subypte with statistical significance, compared to other subtypes of breast cancers.
-When gene expression profilings for 200 TNBC patients were performed and divided into 6 subyptes, A20 expression was significantly increased in LAR subtype of TNBC patients, suggesting a possible role of A20 in TNBC classification.
-BAG2 secretion in the blood of 100 breast cancer patients was evaluated by BAG2-specific sandwich ELISA and significantly increased in breast cancer patients, compared to normal volunteers, suggesting that BAG2-specific diagnosis kit for breast cancers will be successful.
-Through quantitative analysis of BAG2 concentration and circulating tumor cells (CTCs) in the blood of breast cancer patients, we observed significant correlation between the secreted BAG2 and CTCs.

■ Expected outcomes and benefits
-Because we deeply elucidate novel molecular mechanisms of tumorigenesis and metastasis of TNBC by BAG2-Cathepsin B or A20-Snail1 axis, our findings can improve our knowledge of cancer development and metastasis of TNBC.
-If we develop the inhibitory molecules interfering with BAG2-Cathepsin B interaction or A20-Snail1 interaction, it may be valuable molecules for blocking tumor formation or metastasis of TNBC.
-Because we develop the matched monoclonal antibodies for BAG2-specific breast cancer diagnosis kit and have its intellectual property right, we will eventually produce a new breast cancer diagnosis kit through collaborating with biotech company or licensing out.
-BAG2 or A20 expression will be used as a prognostic biomarker to predict a survival rate of breast cancer patients.

(출처 : Project Summary 7p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 요약문 ... 5
• Project Summary ... 7
• 총괄연구과제 연구결과 ... 9
• 1. 총괄연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
• 2. 총괄연구과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 12
• 3. 총괄연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 33
• 4. 총괄연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 37
• 5. 총괄연구과제의 활용계획 ... 58
• 6. 첨부서류 ... 59
• 제1세부연구과제 연구결과 ... 95
• 1. 제1세부연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 96
• 2. 제1세부연구과제의 연구대상 및 방법 ... 96
• 3. 제1세부연구과제의 최종 연구개발결과 ... 99
• 4. 제1세부연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 161
• 5. 제1세부연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 164
• 6. 제1세부연구과제의 활용계획 ... 165
• 7. 참고문헌 ... 165
• 제2세부연구과제 연구결과 ... 167
• 1. 제2세부연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 168
• 2. 제2세부연구과제의 연구대상 및 방법 ... 171
• 3. 제2세부연구과제의 최종 연구개발결과 ... 178
• 4. 제 2세부연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 198
• 5. 제 2세부연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 199
• 6. 제 2세부연구과제의 활용계획 ... 200
• 7. 참고문헌 ... 201
• 끝페이지 ... 202