초록 ▼

경제협력개발기구(OECD)는 화학물질 등의 내분비계 교란 가능성에 대한 1차적 스크리닝을 위해 세포주를 이용한 검색시험법을 개발하고 활용을 권고하고 있다. ‘15년에 채택된 인체 에스트로겐 수용체 결합반응 시험법(TG493)은 방사선 동위원소가 표지된 리간드와 경쟁반응을 통해 세포외에서 물리적인 결합력을 측정하는 원리로 방사선 동위원소를 사용해야하는 위험성이 내재되어있고, 세포내에서의 dimerization 유도 및 이에 따른 전사활성 변화로 이어지는지에 대한 직접적인 증거를 제시하지 못한다는 한계점이 있다.

이에 본

경제협력개발기구(OECD)는 화학물질 등의 내분비계 교란 가능성에 대한 1차적 스크리닝을 위해 세포주를 이용한 검색시험법을 개발하고 활용을 권고하고 있다. ‘15년에 채택된 인체 에스트로겐 수용체 결합반응 시험법(TG493)은 방사선 동위원소가 표지된 리간드와 경쟁반응을 통해 세포외에서 물리적인 결합력을 측정하는 원리로 방사선 동위원소를 사용해야하는 위험성이 내재되어있고, 세포내에서의 dimerization 유도 및 이에 따른 전사활성 변화로 이어지는지에 대한 직접적인 증거를 제시하지 못한다는 한계점이 있다.

이에 본 연구에서는 NanoBRET 기술을 세포주에 적용하여 에스트로겐 및 안드로겐 수용체의 dimerization 반응을 측정할 수 있는 검색시험법을 개발·확립하고 검증연구를 통해 최종적으로 OECD 가이드라인에 등재시키고자 다음과 같이 진행하였다.

에스트로겐/안드로겐 수용체 결합 반응 시험법의 경우 ERα 또는 AR에 Nano Luc, HaloTag 유전자가 융합된 벡터를 제작하고 제한효소 처리 및 염기서열 분석을 통해 클로닝 여부를 확인하였다. 또한, stable cell line 구축을 위한 transfection 조건은 [NLuc-ERα, HT-ERα], [NLuc-AR, AR-HT] 조합과 1:1비율로 확인되었으며, 이 벡터를 HEK293 세포주에 도입한 후 이중항생제 처리를 통해 clone을 확보하고 스크리닝를 거쳐 시험법에 적절한 안정화 세포주를 선별하였다. 선정된 세포주를 이용하여 최적 protocol 및 SOP를 확립하고 study management team(안동대학교)의 관리· 감독 하에 검증연구를 수행하였다. 검증연구는 task group(이화여자대학교)에서 시험물질을 선정하고 암호화하여 각 검증기관 (식품위해평가과, 동국대학교, CamdenBRI, SIUE)으로 전달되어 진행되었다. 연구 결과에 대해 ‘실험실 내 검증(Intra-validation)’, ‘실험실 간 검증(Inter-validation)’을 분석하여 시험법의 재현성과 변동성을 확인하였으며, OECD 가이드라인 채택 추진을 위해 표준업무계획제안서(SPSF)를 제출하였다.

또한, 확립된 시험법 활용을 위해 EPA에서 제시하는 에스트로겐 수용체 결합 반응 물질 85종, 안드로겐 수용체 결합 반응 물질 76종에 대해 스크리닝 한 후 시험물질의 활성과 구조 간의 상관성 분석을 수행하였다.

(출처 : 요약문 3p)

Abstract ▼

The Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) recommends development and a screening test using cell lines for primary screening for the possibility of disrupting endocrine system such as chemicals. The human estrogen receptor binding reaction test (TG493) adopted in 2015 is a pri

The Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) recommends development and a screening test using cell lines for primary screening for the possibility of disrupting endocrine system such as chemicals. The human estrogen receptor binding reaction test (TG493) adopted in 2015 is a principle that measures the physical binding force outside the cells through competitive reactions, and there is an inherent risk of using radioisotopes. In addition, there is a limitation in that it does not provide direct evidence of intracellular dimerization induction and consequent changes in transcriptional activity. In this study, we developed and established a screening test method that can measure the dimerization response of estrogen and androgen receptors by applying NanoBRET technology to cell lines, and finally proceeded as follows in order to be listed in the OECD guidelines through validation studies. In the case of estrogen/androgen receptor binding assay, a vector in which Nano Luc and HaloTag genes were fused to ERα or AR was prepared, and cloning was confirmed through restriction enzyme treatment and nucleotide sequence analysis. In addition, the optimal transfection conditions for establishing a stable cell line were confirmed in a 1:1 ratio with the combination of [NLuc-ERα, HT-ERα], and [NLuc-AR, AR-HT]. After introducing these vectors into the HEK293 cell line, a clone was secured through double antibiotic treatment, and screened to select a stable cell line for the protocol. The optimal protocol and SOP were established using the selected cell line, and validation studies were performed under the management and supervision of the study management team (Andong National University). The validaiton study was conducted by selecting test chemicals from the task group (Ewha Womans University), encoding them, and distributiion to each validation group (Food Risk Assessment Division, Dongguk University, CamdenBRI, Southern Illinois University Edwardsville). Reproducibility and variability of the SOPs were confirmed by analyzing 'inter-laboratory' and 'intra-laboratory' for the research results, and a standard project submission form (SPSF) was submitted to promote adoption of the OECD guidelines. In addition, to utilize the established SOPs, 85 types of estrogen receptor binding chemicals and 76 types of androgen receptor binding chemicals proposed by EPA were screened and analyzed for correlation between the activity and structure of the chemicals.

(출처 : Summary 4p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 자체연구개발과제 최종보고서 ... 2
• 국문 요약문 ... 3
• Summary ... 4
• 목차 ... 5
• Ⅰ. 연구개발과제 연구결과 ... 6
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 6
• 제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 13
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 17
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 187
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 192
• 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 193
• 제7장 참고문헌 ... 195
• 제8장 첨부서류 ... 197
• 끝페이지 ... 252