초록 ▼

최근 암 연구 및 치료 등에 있어서 유전적 특성을 포함한 개인별 차이를 고려하고자 하는 노력이 많이 이루어지고 있다. 이를 위해서는 환자마다 적절한 항암제 선택을 위해 사전에 약물 반응을 예측하여 내성을 판별할 수 있는 시스템이 필요하다. 최근 항암제 내성은 암세포뿐만 아니라 암 미세환경에 의해서도 나타날 수 있음이 보고되고 있다. 그러나 현재까지 내성 기전과 내성 관련 바이오마커 발굴은 암세포 중심으로 이루어져 왔으며, 암을 완전하게 이해하려면 암세포와 암 미세환경을 복합적으로 해석하야 한다. 특히 암 미세환경 구성요소 중 암연관

최근 암 연구 및 치료 등에 있어서 유전적 특성을 포함한 개인별 차이를 고려하고자 하는 노력이 많이 이루어지고 있다. 이를 위해서는 환자마다 적절한 항암제 선택을 위해 사전에 약물 반응을 예측하여 내성을 판별할 수 있는 시스템이 필요하다. 최근 항암제 내성은 암세포뿐만 아니라 암 미세환경에 의해서도 나타날 수 있음이 보고되고 있다. 그러나 현재까지 내성 기전과 내성 관련 바이오마커 발굴은 암세포 중심으로 이루어져 왔으며, 암을 완전하게 이해하려면 암세포와 암 미세환경을 복합적으로 해석하야 한다. 특히 암 미세환경 구성요소 중 암연관 섬유아세포(cancer-associated fibroblast, CAF)가 항암제 내성 발달에 기여할 수 있다는 연구결과가 보고되고 있다.

이에 본 연구에서는 항암제 내성을 암과 암 미세환경을 종합적으로 평가할 수 있는 암 오가노이드 기반 항암제 내성 평가 기술을 마련하고자 하였다. 암 오가노이드는 기존의 암 연구 모델에 비해 경제성과 효율성이 우수하며, 암 환자에 대한 실제 약물반응을 반영할 수 있는 등의 장점이 있다. 본 연구에서는 대장암 환자 조직으로부터 암 오가노이드와 CAF를 확보하고, 특성분석을 통해 항암제 반응성 평가 실험 플랫폼을 구축하였다. 환자별 대장암 오가노이드마다 관찰되는 모양과 크기는 상이했으며, 계대가 반복되어도 일정한 형태를 유지하였다. 성장 속도, 종양 관련 단백질 발현도 대장암 오가노이드마다 다르게 나타났다. 5-FU에 대한 세포독성시험 결과 대장암 오가노이드마다 서로 다른 민감도를 보였으며, 이를 기반으로 자체판별기준에 따라 내성군과 민감군으로 분류하였다. 5-FU에 의한 세포 사멸은 Caspase-3, PARP 단백질의 발현을 통해 apoptosis 경로로 일어남을 확인하였다. CAF는 대장암 환자 조직으로부터 정상 섬유아세포(normal fibroblast, NF)를 짝을 이루어 확보하였으며, CAF 식별 마커 단백질의 발현을 통해 NF와 CAF의 특성이 구분됨을 확인하였다.

CAF가 분비하는 사이토카인을 세포배양액(conditioned medium, CM)을 이용하여 확인한 결과, CAF 마다 과발현 되는 사이토카인은 모두 다르게 나타났다.

환자 유래 대장암 오가노이드 및 내성 유발 CAF로 구성된 항암제 반응성 평가 실험 플랫폼을 이용하여 환자 유래 대장암 오가노이드를 이용한 항암제 내성 평가 시험법을 확립하였다. 확립된 항암제 내성 평가 방법은 5-FU 이외의 다른 항암제에서도 반응 평가가 가능했으며, CAF CM을 항암제와 동시 처리함으로써 CAF에 의한 항암제 내성 유발 평가도 가능함을 확인하였다.

대장암 오가노이드와 항암제 내성 유발 가능성을 보인 CAF를 이용하여 내성 관련 생체지표를 발굴하였다. 5-FU에 대한 민감도가 서로 다른 대장암 오가노이드를 이용하여 2차원 전기영동으로 유의한 발현 차이를 보이는 단백질 spot을 선정하고, MALDI-TOF 분석을 이용해 동정하였다. 동정된 57개의 단백질은 대부분 대사, 단백질 합성과 분해, 세포골격 구성, 전사/번역 조절 등과 관련된 단백질로 확인되었다.

TCGA 생존분석, mRNA 발현 수준, 단백질 발현 수준, 문헌 조사 등을 통해 EZR(Ezrin)과 IMMT(Mitofilin)를 생체지표 후보로 최종 선정하였다. 대장암 세포주 HCT116에서 siRNA를 이용해 해당 유전자의 knockdown을 통해 apoptosis 마커단백질의 발현이 대조군과 비교하여 약 80% 증가한 것을 확인하였다. 대장암 환자 조직을 이용한 면역조직염색 결과, 정상 대장조직 대비 암세포에서 특이적으로 발현되며 환자의 나쁜 예후와 상관성이 있는 것으로 확인되었다. 항암제 내성 유발 평가를 통해 11개의 CAF를 내성 유발군과 비유발군으로 분류하고, 전사체 분석 (mRNA sequencing)을 수행하여 유전자 발현을 비교하였다. DEG(differentially expressed gene) 분석과 TCGA 생존 분석 등을 통해 5-FU 내성 유발군에서 상향 조절되는 유전자 SPP1, ELTD1를 CAF의 항암제 내성 생체지표 후보로 선정하였고 SPP1과 ELTD1은 TCGA 생존 분석 결과 발현이 높은 환자군에서 예후가 나쁘게 나타났다.

본 연구에서는 환자 유래 대장암 오가노이드와 암 미세환경의 주요 구성 세포인 CAF를 이용한 항암제 내성 평가 시험법을 구축하였으며, 이는 신약 후보물질 발굴에 활용될 좋은 모델이 될 수 있을 것이다. 또한 암과 암 미세환경에서 항암제 내성 관련 생체지표를 발굴하였으며, 이들 생체지표 검출을 통해 약물 내성을 예측함으로써 개인맞춤약물 기반 정밀의학 구현에 기초를 제공할 수 있을 것이라 기대한다.

(출처 : 요약문 3p)

Abstract ▼

Nowadays, there has been a lot of efforts to consider individual difference including genetic characteristics in cancer research and clinical trial. For that purpose, in order to select an appropriate anticancer drug for each patient, it is required that a system capable of predicting a drug respons

Nowadays, there has been a lot of efforts to consider individual difference including genetic characteristics in cancer research and clinical trial. For that purpose, in order to select an appropriate anticancer drug for each patient, it is required that a system capable of predicting a drug response and determining resistance. Recently, it has been reported that anticancer drug resistance may be induced not only by cancer cells but also by the tumor micro-environment. In particular, it have been reported that cancer-associated fibroblasts (CAFs), which are major components of the tumor micro-environment, can contribute to the development of anticancer drug resistance. However, many studies about drug resistance have been focused on cancer cells. In this study, we tried to establish an in vitro experimental platform and evaluated the effects of anticancer drug using patient-derived tumor organoids and CAFs. In addition, we investigated biomarkers related 5-fluorouracil(5-FU) resistance using them.

Patient-derived tumor organoids and CAFs were isolated from the tissues of colorectal cancer patients. Based on their characteristic information, we established an experimental platform for evaluating the response of anticancer drugs. Patient-derived tumor organoids showed different physiological properties and different sensitivity for 5-FU, and we classified into resistant and sensitive groups in patient-derived tumor organoids. CAFs were isolated with normal fibroblasts(NFs) in pairs from the tissues of colorectal cancer patients. We confirmed that the characteristics of NF and CAF were distinguished through the expression of the marker proteins.

We have established a method for evaluation of anticancer drug resistance using patient-derived tumor organoids. This method enables evaluation of effect of anticancer drugs and also resistance induced CAF by co-treatment CAF CM with 5-FU.

We explored biomarkers related 5-FU resistance using patient-derived tumor organoids with different sensitivity for 5-FU and CAFs, which have shown the potential to induce resistance to 5-FU. To do that, we used comparative proteomic analysis and mRNA sequencing. Finally, we predicted EZR and IMMT as cancer biomarkers, and SPP1 and ELTD1 as CAF biomarkers. Sensitivity of 5-FU was altered by knockdown of EZR or IMMT using siRNA in HCT116. As a result of immunohistochemistry(IHC) using tissues of colorectal cancer patients, it was confirmed that they are specifically expressed in cancer cells as compared with normal colorectal tissues and protein expression level correlate with the poor prognosis of patients. SPP1 and ELTD1 were observed high expressed mRNA level in 5-FU resistance induced CAFs and had a poorer prognosis in patients with high mRNA expression as a result of TCGA survival analysis.

In this study, we constructed an evaluation system of anticancer drug resistance and investigated biomarkers related for 5-FU resistance using patient-derived tumor organoids and CAFs. We expect that it is to be a good model used for screening new drug candidate substances and possible predicting drug resistance through detection of these biomarkers. In addition, we hope that it could be basis of personalized drug-based precision medical implementations.

(출처 : Summary 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 자체연구개발과제 최종보고서 ... 2
• 국문 요약문 ... 3
• Summary ... 5
• 목차 ... 7
• Ⅰ. 연구개발과제 연구결과 ... 9
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 9
• 제1절 연구개발과제의 목표 ... 9
• 제2절 연구개발과제의 필요성 ... 10
• 제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 19
• 제1절 국내 암 통계 및 대장암 발생 현황 ... 19
• 제2절 대장암 치료에 이용되는 항암제 개발 현황 ... 22
• 제3절 암 오가노이드 연구 현황 ... 25
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 30
• 제1절 암 오가노이드 기반 항암제 반응성 평가 실험 플랫폼 구축 ... 30
• 제2절 대장암 오가노이드의 항암제 내성 평가 시험법 개발 ... 62
• 제3절 항암제(5-FU) 내성 관련 생체지표 발굴 ... 73
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 112
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 115
• 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 116
• 제7장 참고문헌 ... 117
• 제8장 첨부서류 ... 124
• [별첨 1] 환자 유래 대장암 오가노이드의 특성 분석 정보집 ... 124
• [별첨 2] 환자 유래 대장암 오가노이드를 이용한 항암제 내성 평가 방법 ... 150
• [별첨 3] 항암제 내성 관련 생체지표 정보집 ... 166
• 끝페이지 ... 182