□ 연구의 목적 및 내용 ■ 본 연구는 PRC2 복합체의 종양촉진 기능 및 표적 치료 가능성 탐색을 최종목표로 하였으며, 이를 위해 아래와 같은 연구를 수행함 1) 종양 내 발암펩티드에 의한 히스톤 H3K27 메틸화 효소활성변화의 생화학적 분석 2) 히스톤 돌연변이의 매개를 통한 PRC2 활성증진 뇌암 세포주 개발과 이를 이용한 발암촉진 유전자 발굴 3) 뇌암 세포주와 생쥐모델을 이용한 PRC2 복합체 활성저해제의 뇌암치료제 가능성 탐색
■ 3년간 성실히 연구를 수행하였으며, 아래와 같은 결과를 얻
□ 연구의 목적 및 내용 ■ 본 연구는 PRC2 복합체의 종양촉진 기능 및 표적 치료 가능성 탐색을 최종목표로 하였으며, 이를 위해 아래와 같은 연구를 수행함 1) 종양 내 발암펩티드에 의한 히스톤 H3K27 메틸화 효소활성변화의 생화학적 분석 2) 히스톤 돌연변이의 매개를 통한 PRC2 활성증진 뇌암 세포주 개발과 이를 이용한 발암촉진 유전자 발굴 3) 뇌암 세포주와 생쥐모델을 이용한 PRC2 복합체 활성저해제의 뇌암치료제 가능성 탐색
■ 3년간 성실히 연구를 수행하였으며, 아래와 같은 결과를 얻음 ▪ 우리 연구팀과 다른 연구팀들이 그간 소아뇌암과 골암에서 발결한 이형히스톤 H3.3 돌연변이는 세포에서 중요한 후성유전적 변화를 이끌며, 특히 히스톤 H3의 K27 residue가 그 변화의 중심에 있음. 우리는 기존에 H3.3-K27M 돌연변이가 H3K27에 삼중메틸화(H3K27me3) 변형을 붙이는 PRC2 복합체 활성을 억제한다는 것을 밝힌 바 있고, 이와 달리 H3.3-G34R는 H3K27me3를 증가시킬 수 있다는 예비연구 결과를 바탕으로 이에 대한 기전을 연구하기 위해 본 연구를 계획함. ▪ H3K27의 G34R substitution을 지닌 종양원성히스톤 펩티드를 이용하여 히스톤 H3K27 메틸화 효소복합체인 PRC2의 활성을 증가시킴을 확인하였고, 그 외 부가적인 실험들을 통해 in vitro 상에서 H3.3-G34R이 H3K27me3를 약 20% 증가시킴을 보임. ▪ H3.3-G34R를 통한 PRC2 활성 증가가 종양세포에서 미치는 영향을 in vivo에서 확인하기 위해 RCAS/Tva를 활용한 생쥐모델을 개발함. 태아와 신생아 발달과정상 돌연변이를 유도하였을 때 종양이 형성되는 것을 확인하였으며, 특히 생성된 종양은 인간에서 일어나는 소아뇌암의 특성과 유사함을 확인함. ▪ 부가적으로 HeLa, HEK293, U87MG, MG63, U2OS, A172 여섯 종의 세포주를 활용하여 isogenic celllines 모델을 확립하여 이후 기전연구에 활용하였음. ▪ 또한 G34 변형에 대한 이해를 넓히고 RCAS/Tva 소아뇌암 생쥐모델을 활용한 연구에 필요한 후성유전적 도구 개발을 위하여 골암에서의 G34W 변형이 가져오는 후성유전학적 변화와 그 영향에 대해 규명함. G34W 변형은 강력한 DNA hypomethylation을 유도하며 heterochromatin이며 bivalent regions에 작용하는 PRC2를 변화시켜 genomic instability를 유도하고 세포의 분화를 낮추고 증식을 증가시킴.
□ 연구개발성과 < 정량적 성과 > ▪ SCI 저널에 논문 5편이 게재되었으며, 특히 Nature communication, Human molecular genetics, Cancer letter 등 모두 IF 4이상의 분야 상위 저널에 연구결과가 실려, 높은 질적 성과를 보임. ▪ 활발한 국제학술대회 발표로 성과를 공유함. ▪ 판데믹으로 인하여 계획보다 늦어진 동물실험 일정으로 특허의 경우 목표치를 이루지 못하였으나, 이는 대신 계획을 상회하는 연구논문 발표를 이룸. ▪ 소아뇌암 연구에 유용한 세포주모델과 동물보델을 확보한 성과를 이루어 이후 치료제 탐색 등에 유용한 기반을 마련함.
□ 연구개발성과의 활용계획(기대효과) ○ 본 연구의 궁극적 활용은 발암 히스톤 보유 환자들을 위한 맞춤형 치료법을 위한 기전연구로 이후 치료제 탐색에 발판이 되는 6종의 isogenic 세포주 모델과 RCAS/Tva 생쥐모델이라는 동물모델을 확보한 것이 큰 성과임. ○ 종양의 PRC2 복합체에 관한 연구는 현재까지 대부분 EZH2 과발현에 의한 이상으로 제한적으로 연구되었으나, 본 연구는 PRC2 활성 촉진 돌연변이를 보유한 종양에 대한 첫 연구라 사료됨. 또한 전장적 크로마틴 구조의 리모델링을 유도하는 새로운 표적유전자와 Pathway를 발굴한데에도 의의가 있음.
(출처 : 국문 요약문 2p)
Abstract▼
□ Purpose&Contents • The purpose of the study has been to uncover the oncogenic and therapeutic target potential of stimulated PRC2 activity in cancer, with special emphasis on childhoodcancers. • We tackled this question by verifying that histone H3.3-peptides with G34R substitutions have the
□ Purpose&Contents • The purpose of the study has been to uncover the oncogenic and therapeutic target potential of stimulated PRC2 activity in cancer, with special emphasis on childhoodcancers. • We tackled this question by verifying that histone H3.3-peptides with G34R substitutions have the capacity to stimulate PRC2 activity in vitro. We confirmed this to be the casewith HMT assays. • We have established isogenic cell lines by using zinc finger targeting methodology to introduce oncohistone at their endogenous loci into A172 astrocytoma cell line and HeLa cells. • We have completed the proposed RCAS/Tva model from constructs of H3.3-WT, -K27M, and -G34R alterations. This work has been in collaboration with Dr. Squatrito at the Spanish Cancer Center (CNIO, Madrid).
□ Results The histone H3.3 mutations that we and others discovered in pediatric brain and bone tumors have strong epigenetic impact, much of it centered around H3K27 methylation. We published that H3.3-K27M block PRC2 that lay down H3K27me3, and preliminary studies outlined in this project suggested that H3.3-G34R instead stimulate H3K27 methylation. Multiple biochemical evidence in this project prove this to be the case, elevating H3K27me3 in vitro by about 20%. • To test this in tumor material, we have developed a mouse model with H3.3-G34R using the RCAS/Tva model, largely recapitulating the human pedGBM in pathogenesis. • In addition, we have a developed isogenic cell lines carrying H3.3-WT, -K27M, and G34R/W in HeLa, HEK293, U87MG, MG63, U2OS and A172 established cell lines. • To gain further insight in G34 alterations and to implement epigenomic tools to study on RCAS pedGBM, we have concluded a study in giant cell tumor of bone with G34W alterations. There we find strong DNA hypomethylation and an altered PRC2 targeting mainly affect heterochromatic and bivalent regions and provide possible explanations for the genomic instability as well as the osteolytic phenotype of GCTB • This study is in press at Nature Communications: (https://doi.org/10.1038/s41467-020-18955-y).
□ Expected Contribution • Understanding the dynamics of H3K27 methylation remains a critical point in cancer biology. We provide novel insight into its importance for tumor formation and ultimate epigenetic alterations, most notably DNA methylation, when. H3.3 is mutated at distinct residues. • Further studies identifying drugs that balance H3K27 methylation levels are predicted to counteract tumor development in a many solid tumors. Our studies support this notion and we propose to continue research that address those possibilities.
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