초록 ▼

□ 연구의 목적 및 내용
[연구의 목적]
주입형 하이드로겔과 골수유래줄기세포를 이용한 골관절염치료제의 국제공동연구 개발

[연구의 내용]
□ 연구개발 내용 1. 주입형 천연/합성 하이드로겔 제조
○ 젤란검(GG), 히알루론산(HA) 등의 천연재료 고분자 기반 주입형 하이드로겔 제조
- 젤란검 겔 제조
- 천연유래 GG과 탈미네랄화(DBP)겔, HA 및 실크유래 겔과의 복합 제제화
- 하이드로겔의 합성후 시약 잔류량 측정
- 지속기간 조절을 위한 가교방법 확립
- 가교된 하이

□ 연구의 목적 및 내용
[연구의 목적]
주입형 하이드로겔과 골수유래줄기세포를 이용한 골관절염치료제의 국제공동연구 개발

[연구의 내용]
□ 연구개발 내용 1. 주입형 천연/합성 하이드로겔 제조
○ 젤란검(GG), 히알루론산(HA) 등의 천연재료 고분자 기반 주입형 하이드로겔 제조
- 젤란검 겔 제조
- 천연유래 GG과 탈미네랄화(DBP)겔, HA 및 실크유래 겔과의 복합 제제화
- 하이드로겔의 합성후 시약 잔류량 측정
- 지속기간 조절을 위한 가교방법 확립
- 가교된 하이드로겔의 세포독성 및 물성확인(점도, 압출력 등)
○ miRNA 전달용 하이드로겔의 개발과 변종 miRNA 표현형의 조절기술개발
- 골관절염화를 억제하는 miRNA를 하이드로겔에 결합시키는 방법 사용: miRNA-27a, miRNA-27b, miRNA-140, miRNA-146, miRNA-146a 및 miRNA-199a
- 골관절염화를 증진시키는 miRNA를 하이드로겔에 결합시키는 방법 사용: miRNA-9, miRNA-34a, miRNA-98, miRNA-155, miRNA-181a, miRNA-223, miRNA-455-3p 및 miRNA-483-5p등의 miRNA의 인식부위를 하이드로겔에 결합시켜, 재조합을 방지하는 방법사용

□ 연구개발 내용 2: 주입형 천연/합성 하이드로겔의 생체 적합성 평가
○ In vitro 평가
- 줄기세포(BMSC, ACS 세포)를 하이드로겔에 인캡슐화시켜 in vitro 상에서 분자생물학적 평가실시
- 하이드로겔의 생체적 안전성 및 적합성을 평가하기 위해, 줄기 세포와, 타겟세포인 연골세포를 파종하여 부착도, 증식률, 생존률을 확인
○ In vivo 평가
- 하이드로겔 주입시 발생하는 면역거부반응 또는 염증반응에 대한 특성을 확인하기 위해, 제작된 하이드로겔을 마우스의 피하에 이식하여 조직화학적 분석과 분자생물학적 분석을 통해 염증도를 확인
□ 연구개발 내용 3: 줄기세포와 지지체의 혼합비 탐색
○ multiwell plate상에서 줄기세포와 지지체의 최적 혼합비 추적
- 혼합후 1시간, 6시간, 24시간, 72시간, 1주일동안 지지체내 세포의 잔존량 및 세포사 추적
- 혼합후 초기에 세포내에서 성장인자 분비되는지 ELISA를 통해 분석
○ 줄기 세포 혼합비에 따른 지지체의 물성 분석
- 세포혼합비에 따른 pH 분석
- 세포혼합비에 따른 점도변화
- 세포혼합비에 따른 지지체의 분해능 확인
□ 연구개발 내용 4: GLP 수준의 하이드로겔 시제품의 비임상 유효성 검증
○ In vitro 에서 골관절염 질환 치료용 하이드로겔 시제품의 유효성 평가
- 유효성 평가 세포종
줄기세포 및 연골 세포
- 유효성 평가 항목
세포 독성 평가: 세포 생존율, 세포 독성 및 세포 증식률 분석
염증반응: 염증성 사이토카인, 대식세포의 침윤 평가
○ In vivo 에서 골관절염 질환 치료용 하이드로겔 시제품의 유효성 평가
- 유효성 평가 모델
골관절염질환 유발 토끼 모델
- 유효성평가 방법
H&E 염색 : 조직 변화 관찰
Masson’s trichrome staining : 콜라겐 재생 평가

□ 연구개발 내용 5: GG/DBP복합 하이드로겔 지지체의 대량생산(scale-up) 기술개발
○ 양산기술 개발
- 공정개발, Lot 별 제품 균일성
- 고분자의 특성에 따라 교반 속도, 교반 순서 등을 고려하여 균일성이 있는 매뉴얼 작성
□ 연구개발 내용 6: 골관절염 질환치료용 GG기반 하이드로겔의 물리화학적 특성 및 생물학적 안정성 시험 평가
○ 의료기기 해당 KFDA에 질의
○ 물리화학적 특성 및 안정성 시험
- 하이드로겔로 적합한 성능 및 물리·화학적 특성 기준 및 시험방법을 설정하여 제품의 성능 및 물리·화학적 안정성을 확보
- 가속 노화 시험 및 장기 보존 시험을 통해 제품의 유효기간을 설정
- 생물학적 안전성 시험은 식품의약품안전처(MFDS)에서 고시한 의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격과 ISO 10993등에 따름.
생물학적 안전성 시험 항목 : 세포독성, 감작성, 피내반응, 급성독성, 발열성, 이식시험, 유전독성 등

□ 연구개발 내용 7: OA치료용 GG기반 복합하이드로겔 생산을 위한 제조공정 표준화 및 규격화
○ 대량생산 기술 개발 및 제조 공정 밸리데이션을 통한 재현성 구축
- 지지체 제조 공정 기술 개발
- 기술문서 작성 준비 및 구비

□ 연구개발성과
[1단계 및 2단계 성과]
-학술성과는 JCR 상위 20%이내 논문인 ACS Applied Materials & Interfaces, Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications을 비롯하여, Journal of Biomaterials Science: Polymer Edition,Macromolecular Research 등의 SCI(급) 논문 26편, 비 SCI급 논문 3편 총 29편, 성과대비 130% 달성함.
-기술적 성과로 특허 출원은 총 7건을 국내 출원하여, 등록 3건을 달성하여, 성과대비 각각 175%, 300%를 달성하였음.
-인력지원 및 국제 파견부분에서 먼저 인력양성은 석사졸업생 11명(성과대비 220%), 국제 파견은 연구책임자인 강길선교수를 비롯하여 총7명의 연구원이 포르투갈에 파견 되었음, (성과대비 700%)
-국내 및 국제 학술회의 발표 83건, 수상실적 3건으로 각각 성과대비 8300%와 300%를 달성함.
-국제심포지움은 AUSBME 2018, FBPS’2017, pre-FBPS’17을 개최하여, 총 1000여명의 참여인원과 함께 성과대비 100% 달성.
-하이드로겔의 시제품을 제작하고, 이에 대한 생물학적 안정성평가 및 유효성 평가를 (재)한국 기계 전기 전자 시험 연구원에서 검사를 실시한 결과 모두 적합 판정을 받음.

□ 연구개발성과의 활용계획 (기대효과)
□ 기술적 측면
○ 주사용 하이드로겔 과 miRNA함유 나노미립구를 이용한 관절염 치료제의 개발은 병리현상규명을 위한 연골 재생 및 분화 연구에 대한 새로운 접근 방법 치료제시
○ miRNA전달에 대한 새로운 줄기세포유도기술에 대한 패러다임 제시
○ 우리나라 줄기세포 연구는 어느나라보다도 상용화가 활발하여 현재 KPDA허가품목수가 18품목에 상회할 정도로 활발함. 또한 줄기세포제제가 4품목에 이르러 주변기술 또한 활발한 움직임을 보이고 있음
○ 이러한 기술 개발을 방향으로 본 기능성 하이드로겔을 이용한 주사제 OA 관절염 치료제는 치료효능의 혁신적인 개선 효과가 예상됨
□ 경제·산업적 측면
○ 주사용 하이드로겔 제조 기술과 나노미립구제제에 대한 miRNA 전달체의 개발에 따른 생체줄기세포의 분화유도기술의 개발은 의료시장에서의 기존의 치료제를 대체하여 신규시장을 형성 할 것임
○ 하이드로겔제제의 제조기술의 특허 확보와 산업체 기술 이전을 통한 차세대 바이오치료제 산업 선도
○ 골관절염증 및 10대 난치병 치료를 위한 생체줄기세포주 은행 지원 및 의약학산업화 기준 제공
○ 주사용 하이드로겔과 miRNA 전달체를 이용한 신개념의 재생의학적 치료 방법발굴를 통한 막대한 신약개발 대체 효과
○ 포르투갈 팀과 기업 그리고 우리나라의 기업들의 공동연구를 통한 상품화 개발은 상호 각국의 출시와 함께 서로의 시장침투 형성이 용이하여 경제적 파급효과도 클 것이라고 예상됨.

(출처 : 국문 요약문 4p)

Abstract ▼

□ Purpose&Contents
[Purpose of reserch]
An International collaborative research for the development of injectable hydrogels and bone marrow derived stem cell for osteoarthritis treatment

[Contents]
□ R&D Content 1. Preparation of injectable type natural / synthetic hydrogel
○ Prep

□ Purpose&Contents
[Purpose of reserch]
An International collaborative research for the development of injectable hydrogels and bone marrow derived stem cell for osteoarthritis treatment

[Contents]
□ R&D Content 1. Preparation of injectable type natural / synthetic hydrogel
○ Preparation of natural polymer-based injection type hydrogels such as gellan gum (GG) and hyaluronic acid (HA)
- Preparation of gellan gum gel
- Complex formulation with natural derived GG and demineralized (DBP) gel, HA and silk derived gel
- Measurement of residual reagent amount after the synthesis of hydrogel
- Establishment of crosslink method for controlling sustainment time
- Identification of cytotoxicity and physical properties of cross linked hydrogel (viscosity, pressure output, etc.)
○ Development of hydrogel for miRNA delivery and control technology for variant miRNA phenotype
-Use of methods to bind osteoarthritis-inhibiting miRNAs to hydrogels: miRNA-27a, miRNA-27b, miRNA-140, miRNA-146, miRNA-146a and miRNA-199a
- Use of methods to bind osteoarthritis-enhancing miRNAs to hydrogels: Use of methods for preventing recombination by connecting recognition site of miRNA (miRNA-9, miRNA-34a, miRNA-98, miRNA-155, miRNA-181a,miRNA-223, miRNA-455-3p and miRNA-483-5p etc.) with hydrogel
□ R&D Content 2: Biocompatibility evaluation of injectable type natural / synthetic hydrogel
○ In vitro evaluation
- Encapsulating stem cells (BMSC, ACS cells) with hydrogel for the molecular biological evaluation in vitro.
- To evaluate biological stability and suitability of hydrogels, confirmation of adhesion, growth rate, survival rate by seeding stem cells, target cells such as chondrocytes.
○ In vivo evaluation
- In order to confirm the characteristics of immune rejection reaction and inflammatory reaction occurring when the hydrogel is injected, the prepared hydrogel were implanted at subcutaneous tissue of mouse, and the degree of inflammation were observed by using histochemical and molecularbiological techniques.
□ R&D Content 3: Investigating the mixed ratio of stem cells and scaffolds
○ Trace of optimal mix ratio of stem cell and scaffold on multiwell plate
- Cell survival and cell death tracking in scaffold during 1, 6, 24 and 72 hours, 1 week after mixing.
- Analysis of the initial secretion of growth factors in cells by ELISA
○ Analysis of physical properties of scaffolds Depending on the mixing ratio of stem cells
- pH analysis according to mixed cell ratio
- Viscosity change according to mixed cell ratio
- Determination of the resolution of the scaffold according to the mix ratio of cell
□ R&D content 4: Non-clinical validation of GLP-level hydrogel prototype
○ Efficacy evaluation of hydrogel prototype for osteoarthritis disease treatment in vitro
- efficacy evaluation nueroblastoma Stem cells and chondrocytes
- Efficacy Evaluation Items Cytotoxicity Assessment: Cell survival rate, cytotoxicity and cell proliferation assay Inflammatory response: infiltration assessment of inflammatory cytokines, macrophages
○ Evaluation of hydrogel prototype efficacy for osteoarthritis disease treatment in vivo
- Validity assessment model Osteoarthritis-induced rabbit model
- Validity assessment method H & E staining: Observation of tissue changes Masson's trichrome staining: Evaluation of collagen regeneration
□ R&D Contents 5: Development of scale-up technology for hydrogel scaffold
○ Mass production technology development
- Process development, product uniformity per Lot.
- Prepare manual with uniformity considering stirring speed and stirring order according to the characteristics of polymer.
□ R&D Content 6: Physico-chemical properties and biological stability test of GG-based hydrogel for treating osteoarthritis
○ Inquiries KFDA regarding medical devices
○ Physical and chemical properties and stability test
- Ensure product performance and physical and chemical stability by establishing proper performance and physical / chemical properties standards and test methods for hydrogels.
- Accelerated aging test and long-term preservation test (shelf life) to determine the validity period of the product
- Biological safety tests are in accordance with the Common Criteria and ISO 10993 regarding to Biological Safety of Medical Devices Notified by theFood and Drug Administration (MFDS). Biological safety test items: cytotoxicity, sensitization, intradermal response, acute toxicity, febrility, transplantation test, genotoxicity, etc.
□ R&D Content 7: Manufacturing process standardization and tandardization for production of GG-based complex hydrogel for OAtreatment
○ Mass production technology development and manufacturing process validation to build reproducibility
- Development process for scaffold fabrication process
- preparation of technical documents

□ Results
[Step 1 and Step 2, achievement]
-The part of the projects were published within JCR top 20% ranked journals (ACS Applied Materials & Interfaces, Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications), in addition to this articles were also published in the SCI quality journal including Biomaterials Science: Polymer Edition, Macromolecular Research, cumulative of 26 articles, 3 papers were also published in Non SCI journal, so in total 23 papers were published. (Achieved 130% of objective).
-as a result of technological transfer, 7 korean patents were submitted among them 3 has been registered, achieved 175% and 300% results.
-A total of 7 researchers went to portugal (Achieved 700% of objective) for international research training and study along with Research Director (Professor Gilson Khang), and 11 Master Graduates were awarded from this Project (Achieved 220% of objective)
-we conducted International Symposium AUSBME 2018, FBPS’2017 and pre-FBPS’17 with a total participation of 1000 delegates (Achieved 100% ofobjective)
-A prototype made of hydrogel was fabricated and the results of their biological stability and validated evaluation of the prepared prototype were tested and certified by the Korea Electrotechnology & Electronics Research Institute.

□ Expected Contribution
□ Technical aspects
The development of therapeutic agents for arthritis using injectable hydrogel and miRNA-containing nanoparticles is an new approach to cartilageregeneration and differentiation studies to for pathologic characterization.
○ Provide a paradigm of new stem cell induction technology for miRNA delivery
○ Korea's stem cell research is active more than any other countries, so the number of approved items by KPDA is more than 18. In addition, stem cell medicine has reached 4 items, and surrounding technology is alsoactively moving.
○ OA treatment with injection of functional hydrogels based on the development of these technologies are expected to have innovative effects on therapeutic efficacy.

□ Economic and industrial aspects
○ Development of differentiation induction technology of biological stem cells according to development of miRNA delivery system regarding to injectable hydrogel and nanoparticle fabrication will form a new market by replacing existing therapeutic agents in the medical market
○ Leading the next generation of biotechnology industry through acquiring patent for manufacturing technology of hydrogel and transferring technology to industry
○ Supports the stem cell line banking for the treatment of osteoarthritis and 10 other diseases, and provides industrialization standard of medicine
○ substitution effect of enormous new drug development through the discovery of new concept regenerative medicine treatment using injectable hydrogel and miRNA carrier
○ It is expected that the development of commercialization through joint research between Portugal team, enterprises and Korean companies will easily create penetration of each others market as well as economic impact each other.

(출처 : SUMMARY 7p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 국문 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 7
• CONTENTS ... 10
• 목차 ... 11
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 12
• 1-1. 연구개발 목적 ... 12
• 1-2. 연구개발의 필요성 ... 12
• 1-3. 연구개발 범위 ... 17
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 20
• 2-1. 국내·외 기술현황 ... 20
• 2-2. 시장현황 ... 21
• 2-3. 경쟁기관 현황 ... 21
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 22
• 3-1. 연차별 연구 성과, 연구 수행 내용 및 결과 ... 22
• 3-2. 사업화 성과 및 매출 실적 ... 133
• 4. 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 133
• 4-1. 목표달성도 ... 133
• 4-2. 관련분야 기여도 ... 137
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 137
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 141
• 7. 연구개발성과의 보안등급 ... 141
• 8. 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비 현황 ... 141
• 9. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 142
• 10. 연구개발과제의 대표적 연구실적 ... 144
• 11. 기타사항 ... 144
• 12. 참고문헌 ... 145
• 별첨4. 실적 증빙자료 ... 146
• 끝페이지 ... 223