초록 ▼

- 수퍼인핸서는 여러 인핸서들이 모여있는 지역으로 세포의 정체성을 결정하는 중요한 인자로 알려져 있음.
- 수퍼인핸서복합체는 RNA 중합효소와 다양한 전사인자, mediator 단백질로 이루어져 있으며 그 복잡성 때문에 알려진 생화학 기법으로 만들어 내는 것이 매우 어려움.
- 이에 본 연구에서는 Liu, Cell, 2017에서 소개된 방법을 활용하여 불활성화된 Cas9 (dCas9)과 single guide RNA (sgRNA)으로 세포 내에서 특정 유전자좌(locus)를 인식하고 인식한 dCas9를 biotylatio

- 수퍼인핸서는 여러 인핸서들이 모여있는 지역으로 세포의 정체성을 결정하는 중요한 인자로 알려져 있음.
- 수퍼인핸서복합체는 RNA 중합효소와 다양한 전사인자, mediator 단백질로 이루어져 있으며 그 복잡성 때문에 알려진 생화학 기법으로 만들어 내는 것이 매우 어려움.
- 이에 본 연구에서는 Liu, Cell, 2017에서 소개된 방법을 활용하여 불활성화된 Cas9 (dCas9)과 single guide RNA (sgRNA)으로 세포 내에서 특정 유전자좌(locus)를 인식하고 인식한 dCas9를 biotylation시킨 후 이를 streptavidin affinity beads로 pull-down하여 세포 내의 수퍼인핸서 복합체를 분리한 후 cryo-EM imaging을 통해 그 구조를 규명하고자 함
- 이를 위해 적혈모세포의 세포 정체성 유전자인 β-globin cluster의 수퍼인핸서를 타겟 유전자위로 설정하고 β-globin 유전자 발현이 많은 K562세포(erythroleukemia)를 구매하여 배양하였음
- K562세포에서 dCas9, BirA, sgRNA를 안정적으로 발현시키기 위해 lentivirual transduction system을 실험실에 셋업하였음.
- 이후 K562 세포에서 적절한 수준의 dCas9, BirA, sgRNA를 발현하는 stable cellline을 제작하고, 이 세포주에서 구조 연구에 적절한 β-globin cluster의 수퍼인핸서 복합체를 정제하는 방법을 개발할 예정임

(출처 : 초록 3p)

Abstract ▼

Super-enhancer is a region of the genome comprising multiple enhancers that is collectively bound by various transcription factors and RNA polymerases to drive transcription of genes involved in cell identity. Although the concept of super-enhancer has suggested less than a decade ago, super-enhance

Super-enhancer is a region of the genome comprising multiple enhancers that is collectively bound by various transcription factors and RNA polymerases to drive transcription of genes involved in cell identity. Although the concept of super-enhancer has suggested less than a decade ago, super-enhancer has been studied extensively by a variety of methods including genome-wide sequencing techniques such as CHIP-seq, ATAC-seq, and single-cell RNA seq. However, biochemical approaches have not been made due to the heterogeneity and complexity of the super-enhancer complexes. To understand molecular basis of super-enhancer complex formation, we aim to extract and purify super-enhancer complex in situ and apply cryo-electron microscopy (cryo-EM). To do this, we chose a model system – K562 cells and β-globin cluster – and am generating deactivated Cas9, single guide RNA (sgRNA), and BirA expressing stable cell lines via lentiviral injection and screening. In the next year of the research period, we will optimize the in situ purification of intact super-enhancer complex and identify its components by mass spectrometry, DNA-sequencing and RNA-sequencing. In addition, we will visualize the purified complex via cryo-EM for further sample preparation optimization.

(출처 : SUMMARY 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 보고서 초록 ... 3
• 요 약 문 ... 4
• S U M M A R Y ... 5
• C O N T E N T S ... 6
• 목차 ... 7
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 8
• 1. 연구의 목표 ... 8
• 2. 연구의 중요성 ... 8
• (1) RNA 전사 연구의 중요성 ... 8
• (2) 세포 정체성과 수퍼인핸서 연구의 중요성 ... 10
• (3) 수퍼인핸서 구조 규명 연구의 중요성 ... 11
• (4) 유전자좌 (Locus) 특이적 수퍼인핸서 연구의 중요성 ... 12
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 13
• 1. Cryo-EM을 이용한 RNA 중합효소의 구조 연구 ... 13
• 2. 수퍼인핸서 (super-enhancer) ... 14
• 3. 수퍼인핸서 복합체 재조합 ... 14
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 16
• 1. 연구추진 전략 ... 16
• 2. 연구과제 타임라인 ... 16
• 3. 당해년도 연구 결과 ... 16
• 4. 향후 계획 ... 17
• 제 4 장 목표달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 19
• 1. 목표 달성도 ... 19
• 2. 관련분야 기여도 ... 19
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 20
• 제 6 장 참고문헌 ... 21
• 끝페이지 ... 23