[보고서]인삼 및 근연속 식물 고품질 유전체 완성 및 유전체정보 활용기반 구축

양태진

인삼 및 근연속 식물 고품질 유전체 완성 및 유전체정보 활용기반 구축
High quality genome sequencing and establishment of genomics infra for ginseng and related genus 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	서울대학교 Seoul National University
연구책임자	양태진
참여연구자	박지영 , 구현조 , 장우종 , 구현진 , 심현아 , 장예은 , 이원경 , 김민정 , 박영상 , 이세현 , 조우현 , 김수민 , 김진태 , Mohanan Padmanaban , Vo Nogh Linh Giang
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2021-02
과제시작연도	2020
주관부처	농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA)
등록번호	TRKO202100009656
과제고유번호	1395063080
사업명	차세대바이오그린21(R&D)
DB 구축일자	2021-09-18
키워드	두릅나무과.인삼.비교유전체 연구.종판별 기술.염색체 분리 기술.Araliaceae.Panax ginseng.Comparative analysis.Species identification.Chromosome sorting.

초록 ▼

연구의 목적 및 내용
- 인삼의 고품질 유전체를 완성하고 비교유전체 연구를 통해 사배체기원, 환경 저항성 등의 특성을 규명하여 인삼의 유전체정보 활용 기반을 구축한다. 또한 두릅나무과 식물 비교세포유전학 분석을 진행해 종 식별 체계를 확립하고 염색체 분리 유전체 해독기술을 개발한다.
- 2세대, 3세대 유전체 분석 기술인 Illumina, Nanopore, Hi-C 기술을 이용해 고려인삼 자원의 염색체 수준 고품질 표준유전체 정보를 완성하고 이배체와 사배체 인삼종간 및 근연종들의 비교 유전체 연구를 수행하여 사배체 진화기작, 목본과 초본 결정 유전자, 월동 및 음지식물 특성을 이해한다. 또한 다양한 두릅나무과 식물들의 유전체/세포유전학 기반 분류 체계를 구축하고자 하며, 인삼의 분자육종 및 근연종 식물들 종판별에 범용으로 적용될 수 있는 실용적 SNP 칩을 개발하고자 한다. 나아가 염색체 분리 기술을 이용한 유전체 해독 기술을 개발한다.

연구개발성과
- Nanopore, Illumina 시퀀싱 데이터를 이용한 hybrid 어셈블리 pipeline 구축
- Chicago & Hi-C 기술 기반 super scaffolding으로 염색체 수준 pseudomolecule 어셈블 완성 (L90/N50 – 24 scaffolds/163Mb)
- 10,663개의 SNP 정보 기반으로 하여 24 linkage 그룹으로 이루어진 고해상도 인삼 유전지도 완성
- 인삼의 효율적 육종에 적용 가능한 KASP 마커 37개 개발
- 인삼 유전자 지도 기반으로 다수의 assay와 시료를 한번에 분석가능한 고효율의 Fluidigm 기반 SNP 칩 48x48 3세트 개발
- 인삼 속 판별을 위해 26개 KASP 마커를 이용하는 효율적인 마커 시스템 개발
- scaffold 특이 single-copy sequence를 사용한 PLOP을 개발하여 유전체 서열 조립을 선명하게 시각화하여 FISH 검증

연구개발성과의 활용계획(기대효과)
- 인삼 및 근연 식물종, 더 나아가 약용식물의 유전체 연구 및 유전체 기반 육종 분야에 대한 연구 기반 제공
- 인삼 고해상도 유전지도 정보를 이용한 고품질 인삼을 보다 수월하고 빠르게 육성할 수 있는 육종 기반 구축하고 이를 통해 농가의 수량증대 및 인삼의 국가 경쟁력을 확보할 수 있음
- KASP 마커 및 SNP chip 개발로 인삼과 두릅나무과 식물의 효율적 분자육종이 가능해지고 고품질의 육종 기반 확보됨
- 인삼 유전체 서열 조립을 위한 scaffold의 single-copy PLOP FISH 검증은 인삼 유전체 서열 조립 완성도를 향상시킬 것이며 다른 식물 종의 서열조립에도 유용하게 활용될 수 있음

(출처 : 요약문 4p)

Abstract ▼

Purpose&Contents
- Here, we will utilize 2^nd and 3^rd generation sequencing technologies such as Illumina, Nanopore, and Hi-C to complete a high-quality ginseng genome that can be utilized in comparative analyses with diploid and tetraploid Panax species as well as other related species. The ginseng genome will provide clues for the tetraploidization and response to certain environmental factors. Through molecular cytogenetic studies of Araliaceae species, we aim to establish a species identification system and a genome decoding technology through chromosomal separation. Moreover, SNP chips for practical use in ginseng breeding by systematic identification of Panax species as well as related species.

Results
- Established a hybrid assembly pipeline using Nanopore, Illumina sequencing data
- Completed a pseudochromosome level assembly with Chicago & Hi-C technologies (L90/N50 – 24 scaffolds/163Mb)
- Constructed a high-density genetic map consisting of 24 linkage groups and 10,663 SNP information
- Designed 37 KASP markers that can be used in efficient ginseng breeding
- Designed 3 48x48 SNP Fluidigm chip sets derived from the genetic map
- Created an efficient marker system consisting of 26 KASP markers that can distinguish Panax species
- Developed PLOPs derived from scaffold-specific single-copy sequences and visualized genome assembly via FISH

Expected Contribution
- Provide fundamental basis for genome studies of ginseng, related species, and other medicinal plant species as well as genome assisted breeding
- High-quality genetic map information can be utilized for efficient breeding of ginseng, increasing ginseng production in farms and securing national competitiveness
- Efficient molecular breeding can be done for ginseng and Araliaceae plants using KASP and SNP chip markers
- PLOP designed from scaffold-specific single-copy regions will be valuable in genome assembly improvement

(출처 : Summary 5p)

목차 Contents

표지 ... 1
제 출 문 ... 2
보고서 요약서 ... 3
국 문 요 약 문 ... 4
Summary ... 5
목차 ... 6
제 1 장 연구 개발 과제의 개요 ... 7
제1절 연구 개발 목적 ... 7
제2절 연구 개발의 필요성 ... 7
제3절 연구 개발 범위 ... 8
제 2 장 연구 수행 내용 및 결과 ... 10
제 3 장 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 91
제1절 목표대비 달성도 ... 91
제2절 정량적 성과(논문게재, 특허출원, 기타)를 기술 ... 94
제 4 장 연구 결과의 활용 계획 ... 95
제 5 장 연구 개발 결과의 보안 등급 ... 96
제 6 장 연구시설·장비종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비 현황 ... 97
제 7 장 연구개발과제의 대표적 연구실적 ... 98
제 8 장 기타사항 ... 99
제 9 장 참고문헌 ... 100
끝페이지 ... 101

표/그림 (90)

표 나노포어 시퀀싱의 기본 원리. 포어에 ssDNA가 통과하면 흐르던 전류가 방해되어 시그널이 다르게 형성되고 이후에 염기서열로 치환이 가능하다 (Oxford Nanopore Technologies)
표 Chicago & Hi-C 기술 개념도
표 세 개의 제한효소를 이용한 인삼 GBS library 제작과 시퀀싱 개념도
표 KASP 마커 작용 기작
표 KASP 마커 개발을 위한 GBS 데이터 기반 SNP filtering 조건 및 순서
표 Fluidigm 기반 SNP 칩을 이용한 대규모 유전자원의 유전형 분석
표 인삼의 생애주기와 진세노사이드 축적 (Kim YJ et al., 2015)
표 NGS를 이용한 엽록체 및 nrDNA 서열 완성(dnaLCW)과 다양성 분석 전략 모식도
표 두릅나무과 식물 대규모 종 식별 체계 개발 (A. KASP gentyping의 원리 B. Fluidigm 장비 및 실제 genotyping 예시)
표 A) TYP1의 뿌리배양근 한달 가량 배양한 모습 B) GeneAll Exgene Plant SV kit를 이용하여 추출한 gDNA의 전기영동 결과
표 TYP1 gDNA 추출을 하기 위해 시도된 CTAB(cetyl trimethylammonium bromide) 방식 (TYP1C)과 Spooling method(TYP1S)
표 GeneAll Exgene Plant SV kit를 이용하여 추출한 TYP1 gDNA 나노드롭 결과
표 인삼 TYP1 어셈블리에 사용된 시퀀싱 platform별 raw data 정보
표 인삼 TYP1 어셈블리 파이프라인에 따른 어셈블리 현황
표 천풍 Pg_scaffold1212를 TYP1 Pg_typ1_scaffold3686, Pg_typ1_scaffold41와 BLASTZ로 alignment 한 결과
표 천풍 Pg_scaffold1212와 TYP1 Pg_typ1_scaffold3686, Pg_typ1_scaffold41서열간의 유전자 비교
표 TYP1 Pg_typ1_scaffold1, 2, 3, 4와 해당하는 천풍 스캐폴드의 alignment 결과
표 Chicago scaffolding을 이용한 어셈블리 완성도 향상
표 Chicago scaffolding 과정에서의 어셈블리 수정과정
표 Hi-C scaffolding을 이용한 어셈블리 완성도 향상
표 Super scaffolding의 link density histogram
표 Hi-C 스캐폴드와 레퍼런스 엽록체 서열의 BLASTZ 비교
표 Hi-C 스캐폴드 중 엽록체 서열과 레퍼런스 엽록체 서열의 MAFFT alignment 결과
표 미토콘드리아 추정 서열(TYP1_mt)에 raw Nanopore read 매핑 결과
표 미토콘드리아 추정 서열(TYP1_mt)과 NCBI 등록된 미토콘드리아 서열의 BLASTZ alignment 결과
표 TYP1_mt 서열의 annotation 결과
표 가장 긴 23개의 Hi-C 스캐폴드를 천풍 스캐폴드와 비교한 alignment 결과
표 하나의 스캐폴드에 해당하는 linkage group의 유전형 패턴 예시
표 Hi-C 분석을 통해 생성된 24개의 scaffold와 각 scaffold를 대변하는 linkage group의 SNP 수
표 두 개의 스캐폴드에서 제작된 oligoprobe를 이용한 FISH 분석 결과
표 전칠삼 1번 염색체에서 oligoprobe 제작하여 FISH 분석했을 경우 예상 결과
표 PacBio IsoSeq 전사체의 중복 매핑 결과
표 Hi-C 서열 중 paralogous 쌍 후보
표 GBS library별 생산된 서열 정보 요약
표 GBS 과정에 따른 샘플별 평균 read 수의 변화 및 비율
표 Filtering 조건별 SNP 수의 변화
표 dCAPS 마커를 통한 GBS data 검증
표 인삼 고해상도 유전지도
표 인삼 유전지도의 연관군 정보 및 표준유전체 서열의 anchoring 결과
표 KASP 제작을 위해 선발된 SNP들의 HRM 검증 분석 결과 일부
표 다양한 육종자원에 적용한 핵 유전체 서열 기반 KASP 실험 결과 일부
표 비교분석에 이용된 44개의 인삼자원 및 엽록체 서열 정보
표 인삼 엽록체 서열 내 변이 정보
표 다양한 육종자원에 적용한 엽록체 서열 기반 KASP 실험 결과 일부
표 개발된 37개 KASP 마커 정보
표 37개 KASP 마커에 대한 인삼 유전자원 184개체의 유전형 데이터베이스
표 92개체 인삼 유전자원에 적용한 인삼 유전자지도 정보 기반 SNP chip 실험
표 Fluidigm 기반 SNP 마커 131개에 대한 인삼 유전자원 184개체의 유전형 데이터베이스
표 184개체 인삼 유전자원의 유전형 정보를 기반으로 수행한 계통도 분석
표 인삼 39개 조직에서 co-expression analysis
표 인삼에서 PgbHLH1, PgbHLH2 전사인자의 구조(A) 및 서열 alignment 결과(B)
표 meJA 처리 후 시간별 진세노사이드 생합성 관련 유전자 발현 정도
표 1차년도 수집 두릅나무과 식물 14종 (서울대학교 약초원 분양 시료)
표 2차년도 두릅나무과 수집종 Polyscias fruticosa (ORIENTAL MEDICINE LMT 제공, 베트남)
표 베트남 수집 두릅나무과 식물
표 두릅나무과 식물 18점의 신규 NGS 분석 결과
표 두릅나무과 식물 18점 엽록체 유전체 정보
표 완성된 두릅나무과 식물 엽록체 유전체 지도 1
표 완성된 두릅나무과 식물 엽록체 유전체 지도 2
표 두릅나무과 식물 5종의 엽록체 유전체 지도
표 인삼속 판별을 위해 개발된 42개 마커의 종별 Genotype
표 Panax 속 구분을 위한 KASP 마커 적용 결과
표 베트남삼 구분을 위한 dCAPS 마커 적용 결과
표 베트남에서 수집된 114개 Panax 시료의 Genotyping 결과. KASP 마커 26개와 dCAPS 마커 16개를 포함하여 총 42개 마커를 이용함
표 두릅나무과 전장 엽록체 서열을 기반으로 발굴된 SNP 및 Genotype. 전체 14,317개 SNP 중 367개만 나타내었음
표 두릅나무과 종간/속간 구별을 위해 개발된 16개 KASP 마커의 Genotype (A) 및 마커 정보 (B)
표 비교세포 유전학적 분석과정에 대한 모식도
표 핵형분석과 비교유전학적 분석에 사용된 종 정보
표 조직배양을 통해 대량생산한 인삼 배양근(a)과 두릅나무의 발근 유도 과정(b)
표 Flow cytogenetics 기법을 이용한 염색체 sorting 방법
표 Flow histograms of nuclear DNA contents of the 15 Araliaceae species
표 Relationship between karyotype features and nuclear DNA content. Total karyotype and average chromosome lengths against the holoploid genome (A and B), and the monoploid genome (C and D) sizes
표 Summary of chromosome counts, genome sizes, and rDNA FISH signals of 15 Araliaceae species
표 Summary of Araliaceae species, common names, and tissues used for flow cytometric GS analysis
표 Flow histogram of ginseng root culture DNA content. A) Four root cultures; red line for average ginseng DNA content. TYP showed considerably less., B) simultaneous analysis of TYP1 wit other controls., C) chromosome count of TYP1 showed 2n = 44, D) chromosome count of Yunpoong seedling. Scale bar = 10 μm
표 FISH analysis of 5S and 45S rDNA and the (TTTAGGG)n telomere sequence. A) A. cordata, B) A. elata, C) D. morbiferus, D) E. gracilistylus, E) E. senticosus, F) E. sessiliflorus, G) E. sieboldianus, H) F. japonica, I) H. rhombea, J) K. septemlobus, K) P. ginseng, L) P. notoginseng, M) P. quinquefolius, N) P. vietnamensis, O) T. papyrifer . Green, red, and blue signals represent 5S rDNA, 45S rDNA, and telomere, respectively. Sporophytic metaphase chromosome counts are shown in yellow texts. Bar = 10 μm
표 FISH karyogram of the 15 species. A) A. cordata, B) A. elata, C) D. morbiferus, D) E. gracilistylus, E) E. senticosus, F) E. sessiliflorus, G) E. sieboldianus, H) F. japonica, I) H. rhombea, J) K. septemlobus, K) P. ginseng, L) P. notoginseng, M) P. quinquefolius, N) P. vietnamensis, O) T. papyrifer . The 5S and 45S rDNA loci are represented by green arrows and red signals, respectively. Intercalary telomere signals in P. ginseng and P. quinquefolius are denoted by blue arrows. Bar = 10 μm
표 List of primers and oligoprobes used in this study
표 FISH karyogram of ginseng. Upper panel: a) Raw DAPI signals; b) PgDel1; c) PgDel2; d) PgTel; e) Pg167TRa; f) Pg167TRb; g) 5S rDNA; h) 45S rDNA; i) Digital six-color FISH signals of PgDel2, PgTel, Pg167TRa, Pg167TRb, and 5S and 45S rDNA; and j) Merged signals of true five-color FISH (PgDel1, PgDel2, PgTel, Pg167TRa, and Pg167TRb). Lower panel: FISH idiogram of the P. ginseng karyotype showing the distribution of the different REs used in this study. Light-blue chromosomes (13–24) represent the PgDel2-abundant chromosomes
표 Comparative FISH between seedling and hairy roots of ‘Yunpoong’ and TYP1. Monosomic chromosomes are indicated by blue arrowheads
표 FISH karyogram of ‘Yunpoong’ and TYP1. The five-color FISH chromosome identification system enabled identification of monosomic chromosomes in TYP1 (chrs. 7, 13, 16, and 17)
표 FISH ideogram of P. ginseng. A) Complete set of chromosomes (2n=48). B) Aneuploidchromosomes (2n=44). Probe signals were 5S rDNA (green), 45S rDNA (red), PgTR1 (yellow), PgTR3 (purple) and Telomere (blue). Black arrowhead points the unpaired chromosome of the aneuploid P. ginseng Bar = 10 μm
표 List of 47 lineage/species-specific satellite DNAs in ten Araliaceae species. Values are average coverage from NGS read mapping. AE=A. elata, DM=D. morbiferus, ES=E. sessiliflorus, KS=K. septemlobus, PG=P. ginseng, PJ=P. japonicus, PN=P. notoginseng, PQ=P. quinquefolius, PT=P. trifolius, PV=P. vietnamensis
표 Triple-color FISH of rDNA and a 160-bp satDNA common in the tree species. The repeat showed a centromeric distribution in the diploid A. elata while non-centromeric loci were also observed in other tretraploid species. Bar = 10μm
표 Phylogenetic relationship of the 15 Araliaceae species inferred from chloroplast genome sequences. Based on the chromosome number and genome sizes, four independent lineage-specific whole genome duplications can be inferred
표 Metaphasic cell accumulation in hairy root culture and seedling roots. A) Mitotic index (MI) comparison between the transgenic hairy root line culture in 22℃ and 25℃. The black and gray bars represent the total MI at 22℃ and 25℃, respectively. Corresponding hour for each bar is the start hour of APM treatment. A significant increase of mitotic cells (~43%) were observed 13 hours after HU release from roots cultured at 25℃. Whereas lower MI (~14%) were observed 11 hours after HU release from those cultured at 22℃. B) A time series plot of mitotic index measured every hour after root release from two HU concentrations. C) Cells at G1/S phase just before release from HU (0h). D) Cells at different mitotic phases at 13h after release. P=prophase, M=metaphase, A=anaphase, T=telophase. Bars = 20μm
표 Comparison of microtubule inhibitors in accumulating metaphase chromosomes. A) The 3 hourtreatment with 0.5 mpa Nitrous oxide was highly significant in the accumulation of more metaphase spread chromosomes 12th hour after HU release. Treatment of APM diluted either in acetone or DMSO gives lower metaphase index. The peak increased of metaphase cells observed 12 hours after the release from blocking agent. p<0.0001.(n=30). B) Comparative cytological analysis between APM diluted in acetone, C) APM diluted in DMSO and D) Nitrous oxide, showed the amount of metaphase spreads obtained after the 3-hour treatment. Black arrowheads points the metaphase spread chromosomes. Bar = 20 μm
표 List of designed crRNA protospacers to be used to target the 18S region of P. ginseng
표 List of designed crRNA protospacers to be used to target the 5S region of P. ginseng
표 FISH Metaphase A) Single-copy PLOP-FISH from Typ_scaffold1663(=TYP1scaffold0005) and Typ_scaffold1657(=TYP1scaffold0009). Numbers represent chromosome numbers, Bar = 10 μm. B) Chromosome identification using Pg167TRa, Bar = 5 μm

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