[보고서]환경유해인자 모니터링 및 공기정화 식물 개발

홍종찬

보고서 정보

주관연구기관

경상대학교
GyeongSang National University

연구책임자

홍종찬

참여연구자

트린홍키엔 , 송진난 , 레티트랑 , 조유한 , 조창익 , 동바오트람 , 니구엔득친 , 칸티마이흐엉 , 임채오 , 이지민 , 김태윤 , 니구엔티마이 , 니구엔티트랑 , 백주완 , 백무동

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2021-02

과제시작연도

2020

주관부처

농촌진흥청
Rural Development Administration(RDA)

등록번호

TRKO202100009729

과제고유번호

1395063067

사업명

차세대바이오그린21(R&D)

DB 구축일자

2021-09-18

키워드

톨루엔.공기정화.환경유해인자.앱타머센서.형질전환체.toluene.phytoremedi ation of air.xenobiotics.aptamer sensor.transgenic plant.

표 Affinity chromatography방식의 앱타머 선발 방식
표 Affinity chromatography에 의한 Fipronil 앱타머 발굴 방법의 사례 (Int J.Mol.Sci (2018)
표 structural switching 또는 capture select 방식에 의한 앱타머 센서 개발 방법
표 capture select 방법 및 피프로닐 과 counter selection으로 사용한 유사 화합물의 구조 그림
표 피프로닐 앱타머 염기서열 및 검증
표 피프로닐 앱타머 4종의 구조 및 구식 방법에의한 앱타머 구조(좌측)
표 앱타머 Kd측정을 위한 올리고 합성 및 형광물질 및 quancher구조
표 앱타머의 표적 유해성분 결합 친화력 계산법
표 quencher sensor 결합 해리상수 Kd1,eff 측정을 위한 quencher농도별 형광 측정 결과 그림
표 Thioflavin T (ThT) fluorescence label free 앱타머 개발용 화합물 발색원리 및 센서 측정 원리
표 ThT를 사용하여 human telomeric DNA를 찾아내는 방법
표 ThT 매개 센서용 16개의 피프로닐 앱타머 활용 분석 및 신호감도 분석
표 식물의 환경유해인자(xenobiotics) 제거 및 대사경로 Phase I to III
표 동.식물의 세포내에서의 Cytochrome P450(CYP), Glutathion-S-transferase (GST), glycosyl transferase(UGT), ROS 및 Redox signaling, TGA, Glutaredoxin
표 Y2H를 식물 specific GRX인 Roxy18에 결합하는 TF screening 사진
표 환경유해인자 detoxification관련 bZIP family 전체 전사인자 70종과 detox 관련 Redox 조절자의 결합 분석
표 환경유해인자 detoxification관련 전사인자와 활성 조절자로서 Roxy GRX의 결합 네트워크
표 : Detoxification관련 Redox조절자의 target으로서 TCP단백질 돌연변이체의 스트레스 내성 분석 (A) Ten-day-old Arabidopsis seedlings were heat shocked at 42oC, and then transferred to optimal growth conditions at 22oC. Thermo-tolerance of the plants was examined under optimal conditions after a 5 day recovery period. Ten-day-old Arabidopsis seedlings were grown at 22oC for 5 days as a control. Fresh weight (B) resistance rate (C), and chlorophyll contents (D) were measured. The bars indicate the mean ± SE of three technical replicates. The experiment was repeated three times with similar results. Asterisks indicate significant differences compared to WT (p < 0.05, ANOVA)
표 detox관련 TCP 15 돌연변이체의 heat response 분석 Transcript levels of Hsf (A), Hsp and DREB (B) genes in Arabidopsis plants. Expression profiles of 16 Arabidopsis Hsfs, 8 Hsps and 2 dehydration-responsive element binding protein (DREB) genes in wild-type (WT) and tcp15-3 knock-out. The 10-day-old seedlings were exposured to heat stress (37oC) for the several time points (from 0 to 12h). Actin2 was analyzed for control. RT-PCR cycle for most genes was 35, and for HsfA6a, HsfA9, HsfB3, HsfC1, Hsp17.6-CII, Hsp70b, DREB2C, was 40, respectively. The expected sizes of amplicons are indicated in Supplementary Table 1. The experiment was repeated twice with similar results
표 Detoxification관련 TCP 전사인자 항체 생산을 위한 박테리아 단백질 발현 (A) Construction of expression vector. (B) (C) (D) Conditions for protein expression of TCP14, TCP8 and TCP15 C-terminal protein, respectively. (D) Western blot assay indicated the expression of fusion proteins in E.coli BL21(DE3), at 30 degree. T Total protein, S Supernatant, P Pellet
표 생산된 항체의 특이성 분석 (A) (B), Testing of Rabbit á-TCP15 and Rabbit á-TCP14 on bacterial protein and plant extracted protein by western blot assay, respectively
표 항체의 특이성 향상을 위한 항체 정제 (A) schematic of antibody purification process, (B), (C) confirmation of purified Rabbit á-TCP15 and Rabbit á-TCP14 on bacterial protein and plant extracted protein by western blot assay, respectively
표 Toluen 반응 전사조절 인자 리스트
표 환경유해인자 detoxification관련 GRX 결합 단백질 분리
표 환경유해인자 detoxification관련 전사인자와 활성 조절자로서 bZIP 전사인자 결합 네트워크 분석
표 톨루엔 내성 유전자의 식물 형질전환용 벡터 구축. 톨루엔 내성 유전자로 예상되는 CAD, ALDH, SDH cDNA를 분리하고, pCAMBIA1301 벡터를 기반으로 한 식물형질전환용 벡터 구축
표 SDH-promoter:GUS 도입 형질전환체의 톨루엔 처리에 의한 GUS 발현. 톨루엔 처리에 의해 SDH 유전자의 발현이 잎과 뿌리에서 증가됨을 알 수 있다
표 톨루엔 내성을 향상 시킬 것으로 예상되는 SDH1-1, CAD 유전자의 발현 조절에 관여하는 전사인자. SDH1-1 유전자는 DREB2, Hsf에 의해 조절되고 있다. 따라서 DREB2C, HsfA3 전사인자는 톨루엔 내성 유전자들의 발현을 조절할 가능성이 높다
표 Yeast two-hybrid screening을 통해 DREB2C와 결합하는 VOZ1을 분리함
표 Pull-down assay를 통한, DREB2C와 VOZ1의 단백질-단백질 상호 결합. 재조합 단백질 GST-DREB2C (5 μg)와 His-VOZ1 (5 μg)의 western blot analysis
표 VOZ1 단백질의 domain 분석. VOZ1 단백질의 domain 절단 부위와 DREB2C AP2 domain과의 결합. 형질전환된 효모는 5 mM의 3-AT가 포함된 threonine, leucine 결핍배지와 threonine, leucine, histidine 결핍배지에서 배양하였다. 효모 클론의 발색은 filter-lift assay를 통해 확인하였다
표 VOZ1은 DREB2C의 전사 활성을 억제한다. Effector로 35S:DREB2C, 35S:VOZ1을 사용하였고 reporter로는 PromHsfA3:GUS를 사용하였다. Transient promoter activation assay는 애기장대 원형질체 (5x106 ml-1)를 사용하였다. 10 ng의 effector와 reporter, 5 ng의 35S:LUC를 대조구 벡터로 사용하였다
표 VOZ1은 DREB2C의 DNA-binding 활성을 매개한다. x3, x5는 VOZ1 단백질 양을 3배, 5배 증가 시켰다는 것을 나타냄
표 VOZ1, VOZ2 double knockout mutant의 스트레스 저항성. 4일된 대조구, 형질전환체 유묘를 44℃에 35 분간 처리하고 14일 동안 회복시킨 후 관찰함. 신초 중량과 뿌리 길이를 비교하여 스트레스 저항성을 비교하였다
표 환경 스트레스는 DREB2C을 축적 시키고, HsfA3의 발현을 증가 시킨다. VOZ1, 2 double knockout mutant에서는 HsfA3의 축적이 대조구 식물에 비해 더 증대되었다. 정상적인 생장 조건에서 VOZ1은 DREB2C의 DNA-binding domain에 결합하여 DREB2C의 전사활성을 억제 한다. 반면 스트레스 조건이 되면 VOZ는 ubiquitination되어 제거되고 VOZ1으로부터 자유로워진 DREB2C는 다양한 스트레스 유전자들의 발현을 증가시킨다. 증가된 스트레스 내성 유전자들에 의해 식물은 최종적으로 스트레스 내성을 갖게 된다는 신호전달체계를 제안함
표 Yeast-two hybrid법에 의해 분리한 DREB2C AP2-domain과 상호 결합하는 단백질
표 Yeast-two hybrid assay를 통한 DREB2C-CSN5A의 상호 결합 검증
표 Pull-down assay. CSN5A와 GST를 융합한 재조합 단백질 (CSN5A-GST)과 DREB2C에는 His-tag을 융합하여 재조합 단백질 (DREB2C-His)을 E. coli 생성하였다. 각각의 단백질을 분리한 후, 두 단백질의 결합 반응을 수행하고 전기영동하였다. GST, 6xHis monoclonal antibody로 western blot하였다
표 BiFC assay. DREB2C-CSN5A의 결합을 생체내에서 확인하기 위한 BiFC assay. BiFC assay를 위한 4 종류의 벡터구축 지도와 DREB2C-CSN5A의 결합에 의한 형광 발광
표 CSN5A 과잉 발현 형질전환체의 RT-qPCR. 대조구 식물 (Col)에 비해 35S:CSN5A 형질전환 식물체의 CSN5A 전사체 발현량이 높다
표 고염 스트레스 조건에서 발아하는 CSN5A 과잉 발현 형질전환체의 발아 속도 비교. WT, untransformed Col-0; CSN5A-OX5, 6, 12, CSN5A 과잉 발현 형질전환체 계통 5, 6, 12
표 DREB2C 과잉발현 형질전환체의 개화 속도 비교. (A) 파종 후 5 주된 대조구 애기장대와 형질전환 애기장대. (B) 개화 시점에서의 잎 개수 조사. (C) 개화 시간의 비교. WT, untransformed wild-type; 35S Ω:F-DREB2C 형질전환체 계통 L20, L36
표 개화 억제 유전자 FLC의 발현. (A) DREB2C 과잉발현 형질전환체와 대조구 식물체에서의 FLC 유전자 발현의 RT-PCR분석. (B) Image J program에 의한 RT-PCR 발현도 분석. WT, untransformed wild-type; 35SΩ:F-DREB2C 형질전환체 계통 L3, L26
표 발아 과정에서의 AtCYS1 발현. (A) RT-PCR 분석에 의한 시간별 AtCYS1의 발현 변화. (B) Western blot 분석에 의한 종자 발아 과정에서의 AtCYS1 발현량. (C) AtCYS1 promoter:GUS 형질전환체에서의 GUS의 양적 변화. 위, Fluorometric assay를 통해 형질전환체의 GUS activity. 아래, Histochemical GUS staining. (D) 발아과정 중의 CP activity 측정
표 AtCYS1 promoter의 DRE motif에 대한 DREB2C의 결합. (A) AtCYS1 promoter 내에 존재하는 DRE core sequence (wDRE)의 위치를 나타냄. EMSA에 사용된 전체 probe sequence를 나타냄. (B) EMSA에 의한 DREB2C의 DRE 결합력
표 DREB2C는 AtCYS1 유전자의 발현을 증가시킨다. (A) Transient promoter activation assay를 위한 effect와 reporter 벡터 구축도. Effect는 CaMV35S promoter, FLAG (F)-tagged DREB2A 혹은 DREB2C와 nos-terminator로 구축되었다. (B) Effect와 reporter로 형질 전환된 애기장대 원형질체 내에서의 GUS/LUC 활성
표 DREB2C 과잉 발현 형질전환체 내의 AtCYS1 발현. (A) 대조구 식물과 DREB2C 과잉발현 형질전환체 종자 발아 과정에서의 AtCYS1 단백질의 발현을 분석한 western blot assay. (B) ImageJ 프로그램을 이용한 (A) 그림의 양적 분석. (C) DREB2C 과잉발현 형질전환체 종자 발아 과정에서의 CP 활성 분석
표 AtCYS1 형질전환체의 분석. (A) AtCYS1 과잉 발현 형질전환체 생성을 위한 벡터 지도. aphIV는 aminoglycoside phosphotransferase를 암호화하는 유전자로서 형질전환체 선별 항생제 저항성 유전자를 나타낸다. (B) AtCYS1 T-DNA knockout 돌연변이체 (cys1-1)의 T-DNA 삽입도. 검정색 박스는 exon을 나타냄. 화살표들은 돌연변이체의 유전형 분석과 발현량 분석을 위해 사용한 primer의 위치를 나타냄. (D) AtCYS1 과잉 발현 형질전환체의 CP 활성 측정
표 AtCYS1 형질전환체의 종자 발아 속도 비교. 4℃, 3일간 동조화 시킨 후 22℃, long-day 조건에서 발아시켰다. 발아율은 12 시간 간격으로 측정하였으며, radical의 출현 시점을 발아의 시작점으로 하였다
표 DREB2C 도입 후 산호수 재분화식물체 선발 및 증식
표 DREB2C 도입 후 산호수 재분화 식물체 PCR분석
표 DREB2C 도입 후 선발배지에서 재분화된 산호수 식물체 획득 및 PCR 분석에 의한 유전자 도입 확인
표 CYP2E1 유전자 도입 산호수 형질전환체 Southern blot analysis. EcoRI 절단 후 전체 DNA 사진(A) 및 CYP2E1 유전자 도입 확인(B)
표 서던분석에 의해 확인된 산호수 형질전환체의 CYP2E1 유전자 도입 copy 수
표 CYP2E1 도입 산호수 형질전환체의 Northern blot analysis. CYP2E1 mRNA (A) 및 전체 RNA (B). Lane NC: 야생형 산호수로부터 추출한 total RNA; Lane 1-25: CYP2E1 유전자가 도입된 산호수 형질전환체로부터 추출된 total RNA
표 NDPK2 유전자 도입 산호수 형질전환체의 genomic DNA PCR 검정 (A). Lane M: 1kb plus DNA ladder; Lane PC: 재조합 대장균에서 추출한 NDPK2 유전자; Lane NC: 야생형 산호수로부터 추출한 gnomic DNA; Lane 1-30: NDPK2 유전자 도입 산호수 형질전환체. 산호수 형질전환체로부터 NPTI I 유전자의 PCR 검정 (B)
표 NDPK2 유전자 도입 산호수 형질전환체 Southern blot analysis. EcoRI 절단 후 전체 DNA 사진(A) 및 NDPK2 유전자 copy 수 (B) Lane M: Size marker, Lane 1: 비형질전환 산호수; Lane 2-26: NDPK2 유전자가 도입된 산호수 형질전환 계통 NDPK2-3-1, NDPK2-3-2, NDPK2-3-3, NDPK2-3-4, NDPK2-6-2, NDPK2-7-2, NDPK2-9-2, NDPK2-10-2, NDPK2-10-3, NDPK2-10-5, NDPK2-12-1, NDPK2-12-3, NDPK2-12-4, NDPK2-13-3, NDPK2-15-1, NDPK2-15-3, NDPK2-15-5, NDPK2-22-1, NDPK2-22-2, NDPK2-22-4, NDPK2-22-5, NDPK2-23-1, NDPK2-39-1
표 NDPK2 도입 산호수 형질전환체의 목표 유전자 도입 copy 수
표 NDPK2 도입 형질전환 산호수의 톨루엔 비처리구 (Non-treatment) 및 처리구 (Toluene treatment)간 qRT-PCR 분석
표 CYP2E1 및 NDPK2 도입 산호수 형질전환체 기내 계대배양 및 온실 재배 개체 수
표 기내 계대배양(좌) 및 온실에서 재배관리(우)하고 있는 CYP2E1 및 NDPK2 도입 산호수 형질전환체
표 기내 계대배양 중인 DREB2C 도입 후 선발배지에서 재분화된 산호수 식물체
표 CYP2E1 도입 형질전환 산호수의 톨루엔 저감 능력 검정
표 NDPK2 형질전환 산호수의 톨루엔 저감 능력 검정
표 CYP2E1 유전자 항체 제작
표 형질전환 산호수로 부터 CYP2E1 단백질 발현 확인. SDS-PAGE (A) 및 Western blot analysis (B). Lane M: Pre-stained protein marker (Bio-Rad); Lane PC : Recombinant rabbit CYP2E1 protein derived from E.coli; Lane NC : 비형질전환 산호수의 전체 잎 단백질; Lane 1-12 : 형질전환 산호수 라인들의 잎 단백질: 2-1, 2-2, 3-3, 3-4, 6-1, 6-2, 6-5, 20-3, 24-3, 35-1, 54-1, 54-2
표 형질전환 산호수의 CYP2E1 효소 활성 측정
표 형질전환 산호수로 부터 NDPK2 단백질 발현 확인. SDS-PAGE (A) 및 Western blot analysis (B). Lane M: Pre-stained protein marker(Bio-Rad); Lane PC: Recombinant rabbit NDPK2 protein derived from E.coli; Lane NC: 비형질전환 산호수; Lane 1-6: NDPK2-3-1, NDPK2-7-2, NDPK2-10-5, NDPK2-12-4, NDPK2-13-3, NDPK2-15-1 계통
표 CYP2E1 유전자 삽입 형질전환 산호수의 Flanking DNA Sequencing. 제한효소를 이용한 유전자 삽입 개수 확인(A), CYP2E1 유전자 도입 산호수 지놈내 주변 염기 서열(B)
표 NDPK2 유전자 도입 형질전환 산호수의 Flanking T-DNA Sequencing. 제한효소를 이용한 유전자 삽입 개수 확인(A), NDPK2 유전자 도입 산호수 지놈내 주변 염기 서열(B)
표 톨루엔 처리 전후 산호수 간 유의하게 발현된 전사 유전자 수
표 애기장대 유전자와 match된 전사 유전자의 기능적 구분
표 Metabolic pathway 관련 전사 유전자 목록: 19(과발현 16, 저발현 3)
표 Treatment of toluene to Scindapsus (Epipremnum aureum) in the sealed chamber and gas chromatography instrument
표 잎 왁스 층에 흡착된 미세먼지 측정하는 무게 분석법 과정
표 잎을 자른 후 미세먼지 탈착(좌, Cutted leaves)과 잎을 자르지 않은 처리(dn, Intact leaves)
표 Toluene 처리 후 Syth-MS을 이용한 식물의 톨루엔 제거 능력 평가
표 조경식물의 잎 왁스층 분리
표 조경식물에 의한 미세먼지 저감 효과 측정
표 Hierarchiral clustering and heatmap showing DEGs in Arabidopsis seedlings exposed to toluene for 30 min, 1 h and 4 h
표 Alignment statistics result
표 Read alignment of Control and 1-hour toluene-treated Arabidopsis samples
표 Average mapping coverage of Control and 1-hour toluene-treated Arabidopsis
표 Number of genes and transcripts from Control and toluene-treated Arabidopsis
표 Differentially expressed genes in toluene-treated Arabidopsis
표 Upregulated and downregulated genes in Arabidopsis exposed to toluene
표 Scatter plot of expression level of Control vs. toluene-treated Arabidopsis
표 Volcano plot of significant expressed genes between Control and toluene-treated Arabidopsis plants
표 Volcano plot of significant expressed genes between Control and toluene-treated Arabidopsis plants
표 Selected upregulated genes (21 out of 513 upregulated genes)
표 GO categories in Control vs 1-hour toluene-treated Arabidopsis
표 Number of genes involved in molecular functions toluene-treated Arabidopsis
표 Number of genes pertinent to biological processes associated with toluene exposure of Arabidopsis
표 Number of genes involved in cellular component of Arabidopsis exposed to toluene
표 Particle sedimentation in the empty chamber
표 PM mass in closed chamber with plants and empty chamber
표 Reduction in PM2.5 and PM10 after 4 hours, depending on the plant volume in the chamber, by 10 species
표 Mass reduction of PM2.5 and PM10 by plants with different leaf shapes
표 PM2.5 and PM10 mass reduction by plants after 2 and 4 hours exposure with different leaf shapes. PM mass was calculated by subtracting the PM mass in the empty chamber from the PM mass in chamber with plants then divided by the leaf area. Different letters indicate significant differences among means by 5% DMRT
표 Mass reduction of PM2.5 and PM10 by plants with different tree shapes
표 PM2.5 and PM10 mass reduction by plants after 2 and 4 hours exposure with different tree shapes. PM mass was calculated by subtracting the PM mass in the empty chamber from the PM mass in chamber with plants then divided by the leaf area
표 Mass reduction of PM2.5 and PM10 by plants with different leaf seasonal characteristics
표 PM2.5 and PM10 mass reduction by plants after 2 and 4 hours exposure with different leaf seasonal characteristics. PM mass was calculated by subtracting the PM mass in the empty chamber from the PM mass in chamber with plants then divided by the leaf area
표 PM2.5 mass reduction by leaf area after 4 hours exposure
표 Candidate gene search and primers for RNA activity analysis
표 Work flow of RNA analysis
표 RNA 샘플 QC 결과
표 수종별 왁스층의 무게
표 그룹별 왁스 층 무게
표 잎의 유형별 왁스 층 무게
표 침엽수와 활엽수의 엽면적 기준 미세먼지 저감량
표 엽면적기준 PM2.5 제거량과 왁스함량의 상관관계 분석
표 시간 경과에 따른 미세먼지 변화량(좌: PM2.5, 우: PM10)
표 엽면적 기준 미세먼지 저감 효율(좌: 2시간 후, 우: 4시간 후)
표 파키라 잎에 흡착된 미세먼지 입자 크기별 중량법으로 제거량 측정 (PM2.5 exposure: 300ug/m3 4h, 처리 전 측정할 잎 Wash 함)
표 백량금 잎에 흡착된 미세먼지 입자 크기별 중량법으로 제거량 측정 (PM2.5 exposure: 300ug/m3 4h, 처리 전 측정할 잎 Wash 함)
표 필로로덴드론‘콩고’잎에 흡착된 미세먼지 입자 크기별 중량법으로 제거량 측정 (PM2.5 exposure: 300ug/m3 4h, 처리 전 측정할 잎 Wash 함)
표 Real-time PCR을 이용한 식물의 유전자 발현량을 측정하기 위한 primer
표 real-time PCR을 이용한 WRKY DNA-binding protein 40 (AT1G80840.1)
표 초본 식물의 toluene 능력. (a), 식물의 시간당 toluene 제거량; (b) 식물의 시간당 평균 toluene 제거량
표 목본식물의 toluene 능력. (a), 식물의 시간당 toluene 제거량; (b) 식물의 시간당 평균 toluene 제거량
표 조경식물의 잎 왁스층 함량
표 해당화 잎의 왁스 함량
표 식물별 미세먼지(PM2.5) 제거 효율 및 왁스층 함량
표 조경식물의 미세먼지 PM1 제거효율
표 조경식물의 미세먼지 PM2.5 제거효율
표 조경식물의 미세먼지 PM7 제거효율
표 조경식물의 미세먼지 PM10 제거효율
표 조경식물의 미세먼지 TSP 제거효율
표 조경식물의 시간당 PM2.5 제거 효율
표 조경식물의 시간당 PM10 제거 효율
표 이끼 식물을 활용하여 미세먼지 저감 능력 증진을 위해 개발한 식물공기정화재배 전체 시스템
표 이끼를 이용한 식물공기정화재배 시스템 구조도(이끼를 층층이 수평으로 배열)
표 이끼를 이용한 식물공기정화재배 시스템 관수, 광 및 식물 교체 시스템

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