[보고서]고수익성 비식용 GM 원예작물의 안전성 평가 및 기술 개발

이효연

고수익성 비식용 GM 원예작물의 안전성 평가 및 기술 개발
Studies on safety of highly profitable non-food GM horticultural crops 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	제주대학교 Cheju National University
연구책임자	이효연
참여연구자	선현진 , 진일두 , 박미영 , 강홍규 , 최수정 , 정혜린 , 한승섭 , 서석철 , 박미영 , 남지영 , 전정은
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2021-01
과제시작연도	2020
주관부처	농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA)
등록번호	TRKO202100010061
과제고유번호	1395062860
사업명	차세대바이오그린21(R&D)
DB 구축일자	2021-10-09
키워드	비식용작물.유전자변형작물.잔디.폐튜니아.위해성평가.non-food crop.GM crop.zoysiagrass.petunia.LMO risk assessment.

초록 ▼

비식용작물인 종간교배종 제초제내성 GM잔디의 농업형질, 유전자이동성, 잡초화가능성 평가시험 및 주변생태계(미생물, 곤충, 수생생물)에 대한 영향 평가 시험을 수행하였음. 또한 복수세대동안 도입유전자 서열의 안정성, 도입유전자위치의 안정성 및 발현안정성 시험을 통해 도입유전자의 안정성를 확인하였음. 비의도적 환경방출을 방지하기 위하여 이벤트 LMO 잔디 재배포장 격리펜스 바깥 주변지역의 잔디를 모니터링 하였음. RsMYB1이 도입된 페튜니아의 도입특성을 연구하였음. 특히 안토시아닌의 축적과 화색, 무생물스트레스내성, pH변화에 대한

Abstract ▼

Purpose & Contents
Purpose: Studies on LMO safety assessment to commercialize GM events of zoysiagrass and petunia, highly profitable non-food crops.

Contents:
- Evaluation of agronomic characters, gene-flow, weediness and impact on non-targeting organisms of the herbicide-tolerant zoysiagrass, an interspecific LMO event.
- Identification of stability of the inserted DNA in the hybrid GM zoysiagrass from generation to generation
- Monitering unintentional escape of the LMO into environment
- Selection of an elite line through characterization of a GM petunia with overexpression of RsMYB1
- Basic study for LMO safety assessment of the LMO RsMYB1-petunia

Results
- Investigated agronomic characters, gene-flow, weediness and impact of the interspecific LMO zoysiagrass event on non-targeting organisms
- Identified stability of the inserted DNA in the GM zoysiagrass event from generation to generation
- Performed GMO strip test of wild zoysigrass around the fence of the LMO field growing the event zoysiagrass during field test period
- Identified stability of anthocyanin accumulationin petunia carrying RsMYB1 from generation to generation
- Identified enhancement of heavy metal tolerance and abiotic stress tolerance in petunia carrying RsMYB1
- Performed DNA sequencing of both regions flanking T-DNA in petunia carrying RsMYB1
- Tried experiments for LMO environmental assessment of petunia carrying RsMYB1
- 11 SCI and 및 2 non-SCI papers
- 2 patent applications

Expected Contribution
- Improving social awareness of GMO crops produced in our country
- Applicable to commercialization of other non-food horticultural GM crops
- Contributing to the practical application of interspecific GM high-quality grass varieties
- Useful as basic data for practical application of a high-quality GM petunia

(출처 : Summary 5p)

목차 Contents

표지 ... 1
제 출 문 ... 2
보고서 요약서 ... 3
국 문 요 약 문 ... 4
Summary ... 5
목차 ... 6
제 1 장 연구 개발 과제의 개요 ... 7
제1절 연구 개발 목적 ... 7
제2절 연구 개발의 필요성 ... 7
제3절 연구 개발 범위 ... 10
제 2 장 연구 수행 내용 및 결과 ... 11
제1절 이론적 접근방법 ... 11
제2절 실험적 접근방법 ... 11
제3절 연구내용 ... 11
제4절 연구결과 ... 20
제 3 장 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 72
제1절 목표대비 달성도 ... 72
제2절 정량적 성과(논문게재, 특허출원, 기타)를 기술 ... 74
제 4 장 연구 결과의 활용 계획 ... 75
제1절 추가연구의 필요성 ... 75
제2절 타 연구에의 응용 ... 75
제3절 기업화 추진방안 ... 75
제4절 현재 추진 중인 추가적인 논문게재, 산업재산권 출원 사항 ... 75
제 5 장 연구 개발 결과의 보안 등급 ... 76
제 6 장 연구시설·장비종합정보시스템에등록한 연구시설·장비현황 ... 76
제 7 장 연구개발과제의 대표적 연구실적 ... 77
제 8 장 기타사항 ... 79
제 9 장 참고문헌 ... 80
끝페이지 ... 81

표/그림 (82)

표 Zebrafish의 사육 조건
표 사료 기호도 평가 모습. A, 전체 시험구 배치 사진; 1, 들잔디; 2, 이탈리안라이그라스; 3, 티모시; 4, 클라인그라스
표 사양시험에 타른 처리구별 시험사료 급여량
표 형질전환체의 안토시안닌 합성관련 유전자 탐지용 primer
표 이벤트 잔디의 삽목을 통한 증식 및 포장 조성
표 이벤트 잔디의 유전자이동성평가 구역 조성. 좌, 단방향 모형; 우, 8방향 모형
표 이벤트 잔디의 대량 증식 포장 조성 및 관리(2019년 10월 현재)
표 JG21-MJ의 형태적 특성. A, 2018년 제주대학교_제주시 LMO격리포장. B, 2018년 제주대학교_남원 LMO격리포장
표 JG21-MJ 잔디와 대조구 잔디의 형태적 특성 비교
표 이벤트 잔디 종자의 자연발아율 조사 사진. 각 잔디별로 각각 3개의 화분에 종자를 파종하였음(화분 1개당 파종 종자 수는 700립, 각 잔디별 파종 종자 수는 총 2,100립). A,2018년. B, 2019년
표 잔디 종자의 자연발아율 조사 (2018-2020년)
표 유전자이동성평가 구역 조성. 좌, 단방향 모형; 우, 8방향 모형
표 근거리 모형에서의 유전자이동성 평가 결과
표 중거리(8방향) 모형에서의 유전자이동성 평가 결과
표 원거리(단방향) 모형에서의 유전자이동성 평가 결과(2019)
표 원거리(단방향) 모형에서의 유전자이동성 평가 결과(2020)
표 교배종 잔디의 잡초화가능성 평가 구역 (2019년 10월 24일).1, 관리구(JG21-MJ); 2, 관리구(대조구 잔디); 3, 비관리구(대조구 잔디); 4, 비관리구(JG21-MJ)
표 잡초화 가능성 평가 구역 내에 침입한 잡초 종류
표 관리구역 및 비관리구역에 침입한 잡초 종 및 개체 수
표 교배종 잔디의 잡초화가능성 평가 구역 조성 (2019년 10월 24일). 1, 관리구(JG21-MJ); 2, 관리구(대조구 잔디); 3, 비관리구(대조구 잔디); 4, 비관리구 (JG21-MJ)
표 교배종 잔디의 잡초와의 경쟁성 평가. 1, 관리구(JG21-MJ); 2, 관리구(대조구 잔디); 3, 비관리구(대조구 잔디); 4, 비관리구(JG21-MJ)
표 도입유전자 우측 염기서열의 확인. 검정색, 오른쪽 주변염기서열 영역. 파란색, 도입유전자 영역. JG21과 JG21-MJ3(MJ)에서 각각 3반복 염기서열 분석
표 도입유전자 좌측 염기서열의 확인. 검정색, 왼쪽 주변염기서열 영역. 파란색, 도입유전자 영역. JG21과 JG21-MJ3(MJ)에서 각각 3반복 염기서열 분석
표 JG21-MJ 들잔디에 도입된 유전자 요소의 genomic Southern blot 분석. (A) bar (B) Ubiquitin promoter. WT, widl type(음성대조구). JG21, 참조구. MJ, JG21-MJ3, pGPTVHB, 도입 바이너리 벡터(양성 대조구). M, size marker(λHindIII). H, HindIII. E, EcoRI
표 유전자도입을 위해 사용된 벡터(pGPTVHB)의 T-DNA 바깥영역(backbone)의 비의도적 도입 가능성을 확인하기 위한 genomic Southern blot 분석. (A) backbone DNA probe 결과. (B) 양성대조구, bar probe 결과. JG21, 참조구. MJ, JG21-MJ3, pGPTVHB, 도입 바이너리 벡터(양성 대조구). M, size marker(λHindIII). H, HindIII. E, EcoRI
표 JG21-MJ 들잔디 복수세대의 genomic Southern blot 분석. A, bar. B, Ubiquitin promoter. C, Arbc terminator. D, HPH (삽입되지 않은 LB 끝부분). E, probe의 위치를 표시한 도입벡터(pGPTVHB)의 T-DNA 지도. WT, widl type(음성대 조구). JG21, 참조구. MJ, JG21-MJ3. MJ#3 MJ#8 MJ#203, Progenies of JG21-MJ3. M, size marker(λHindIII). H, HindIII. E, EcoRI
표 F3 세대에서 도입유전자 염기서열 안정성 검정. Genomic DNA blot방법을 이용하였음
표 복수세대 및 복수년 동안 bar 유전자의 발현 안정성 평가. Zj, 야생형 Zoysia japonica. Zm, 야생형 Zoysia matrella. #202, 바스타 감수성 분리 계통. RT-PCR에서 모든 바스타 저항성 계통은 bar 유전자가 증폭되지만, 야생형과 바스타 감수성 계통은 bar 유전자가 증폭되지 않았음
표 T-DNA 유전자형을 검정하기 위한 F3 식물체
표 PCR을 이용한 형질전환 식물체의 genotyping 원리. 도입유전자(T-DNA)와 그 주변염기서열을 이용하여 두 세트의 specific primer를 제작함. 검정색 프라이머 세트는 T-DNA를 가진 개체를 검출하기 위한 세트이고 빨강색 프라이머 세트는 T-DNA가 없는 개체를 검출하기 위해 세트임. 정확성을 높이기 위해 각각의 세트에서 double PCR을 수행하였음. 오른쪽 그림은 agarose gel 상에서 예측되는 homo, hetero, WT의 증폭된 DNA band 패턴임
표 T-DNA가 들어있는 개체를 증폭하기 위한 PCR. double PCR 결과 예측된 크기의 DNA가 증폭되었음. FP1: 5‘-CTTGG TACAG GCCTG CGTCT CCG-3’, RP1: 5’-GGCGA ATGAG CTTGC ATGCC-3. FP2: 5’-ACGGC ATCAT CGTCG CATGC C-3’ RP2: 5’-TGGCT CCTTC AACGT TGCGG TTC-3’
표 T-DNA가 들어 있지 않은 개체를 증폭하기 위한 PCR. double PCR 결과 특이적인 DNA를 안정적으로 증폭하지 못하였음. FP1: 5‘-CTTGG TACAG GCCTG CGTCT CCG-3’, RP1: 5’-GTTGA CGACA TCTAT GGACC A-3. FP2: 5’-ACGGC ATCAT CGTCG CATGC C-3’ RP2: 5’-AACTA AAAGA TGGCT CAAAA TGTA -3’
표 PCR을 이용한 집수정 수생미생물로의 수평유전자전달 조사. A, 해당 시료에서 추출한 genomic DNA (M, 100bp plus ladder marker; MJ, JG21-MJ잔디에서 추출한 DNA; 1-3, 집수정 미생물에서 추출한 DNA). B, A에서 제시한 해당 genomic DNA의 PCR 결과. 양성대조군으로 사용한 JG21-MJ에서만 DNA가 증폭됨
표 잔디 추출물을 처리한 zebrafish의 생존율
표 잔디 추출물을 처리한 zebrafish의 부화율
표 잔디 추출물을 처리한 zebrafish의 시간경과에 따른 형태학적 변화 관찰
표 잔디 추출물을 처리한 zebrafish의 심박수
표 잔디 추출물을 처리한 zebrafish의 부종크기
표 모품종 및 JG21-MJ잔디 재배포장에 서식하는 곤충 분포 (2019년)
표 모품종 및 JG21-MJ 잔디 재배포장에 서식하는 곤충 분포 (2020년)
표 단일 사료 처리구에서의 사료 섭취량 조사
표 동시 사료 처리구에서의 사료 섭취량 조사
표 야생형(WT)과 JG21-MJ 잔디 포장에 존재하는 토양세균의 다양성
표 재조합 유전자의 토양미생물로의 수평유전자전달 조사. PCR 산물은 1% 아가로스 겔을 사용하여 전기영동 하였음. M, size marker (100 bp ladder); C, pGPTV-HB DNA (positive control); WT_1, WT_2, 야생형; MJ_1, MJ_2, JG21-MJ
표 JG21-MJ 잔디의 주변환경에 대한 비의도적 영향 모니터링 결과
표 제주대학교 GM잔디 재배 포장 주변 환경 모니터링
표 서귀포 남원읍 GM잔디 재배 포장 주변 환경 모니터링
표 2018년 JG21-MJ 잔디의 농업 형질
표 GM잔디와 일반잔디의 판별 방법
표 들잔디와 금잔디의 판별 방법
표 식물영양조직에서 안토시아닌 축적 비교 (A; 잎, B; 줄기, and C; 뿌리) and D; their total anthocyanin contents of WT and the transgeniclines (PM2 and PM6) expressing RsMYB1. The bars represent mean values of samples tested in triplicate (±) with standard error
표 WT과 RsMYB1를 발현하는 PM2과 PM6에서 화기 표현형(A) RsMYB1의 전사체 수준(B), (C) 안토시아닌 함량의 비교. The bars represent mean values of samples tested in triplicate (±) with standard error
표 6주 동안 온실에서 자란 T2-PM6, T2-PM2, WT 식물체에서 안토시아닌 함량 (A)과 DPPH(B)와 ABTS(C) assay에 의한 ROS-scavenging 활성 비교. Error bars indicate the standard errors of the mean. FW, fresh weight
표 다양한 중금속을 처리한 T2-PM6, T2-PM2, WT 간의 식물체 길이(A)와 생체 중량(B)의 비교. 데이터는 실험 시작 후 30일째 얻었음. Error bars show the standard errors of the mean
표 다양한 중금속 스트레스에 의해 야기된 T2-PM6와 WT 식물체 간의 중금속 독성 비교. Photographs were taken on the 30th day after starting the experiments
표 형질전환 식물체의 클로로필 함량분석
표 형질전환 식물체의 RWC 함량분석
표 RsMYB1-overexpressing 식물체와 WT 식물체 간의 다양한 중금속 스트레스에 의해 야기된 공변세포 감소 비교. Photographs were taken on the 30th day after starting the experiments
표 중금속노출 후 T2-PM6, T2-PM2 식물체, WT 식물체 간의 공변세포 밀도 비교. 데이터는 실험 시작 후 30일째 날에 얻었음. Error bars show the standard errors of the mean
표 중금속 처리 후 T2-PM6, T2-PM2 식물체와 WT 식물체에서 항산화 관련 유전자들의 발현 분석. Superoxide dismutase(SOD, A), catalase(CAT, B), peroxidase(POX, C). D데이터는 실험 시작 후 30일째 날에 얻었음. Error bars show the standard errors of the mean
표 중금속 처리 후 T2-PM6, T2-PM2 식물체와 WT 식물체에서 중금속 스트레스 내성 유전자들의 발현 분석. Glutathione S-transferase(GST, A), phytochelatin synthase(PCS, B). 데이터는 실험 시작 후 30일째 날에 얻었음. Error bars show the standard errors of the mean
표 BASTA 저항성 검정 및 도입유전자 발현 분석 등을 통한 T4세대 진전
표 안토시아닌 함량 비교(A). DPPH에 의한 ROS-제거 활성 비교(B). ABTS 분석(C). 시료, 온실에서 6주 동안 배양된 T2-PM6,T2-PM2, the wild-type (WT) 식물체. Error bars, 평균값의 standard errors. FW, fresh weight
표 야생과 유전자변형 식물의 pH 값이 다른 30일 후 묘목의 생장 변수. 식물의 키, 뿌리 생장, 엽수, 생물중(FW), 엽면적, 새싹수 분석. 데이터는 10 반복의 평균임
표 서로 다른 pH 농도 하에서 30일 처리 후 야생 및 형질전환 묘목의 안토시아닌 함량의 축적
표 서로 다른 pH 농도 하에서 30일 처리 후 야생 및 유전자변형 묘목의 안토시아닌 함량의 축적
표 30 일 처리 후 야생형 및 형질전환 묘목에서 안토시아닌 생합성 유전자의 발현에 대한 서로 다른 pH 값의 효과. qRT_PCR 방법에 의해 유전자 발현 수준 측정. Data는 3반복의 평균임. Bars, standard errors(SE)
표 30 일 처리 후 2 개의 pH 수준에서 성장한 야생형 및 형질전환 페튜니아잎에서 SOD, CAT, POX 및 MYO 유전자의 상대 발현 비(각각의 유전자에 대한 튜불린 발현의 비율). 각 값은 세 번의 반복 실험의 평균 ± 표준 오차
표 서로 다른 pH로 30일 처리 후 야생형과 형질전환체 유묘 줄기의 주사전자현미경 분석
표 서로 다른 pH로 30일 처리 후 야생형과 형질전환체 잎 표면의 주사전자현미경 분석
표 Effect of different pH values on uptake mineral nutrients in 야생형과 형질전환체의 무기영양소 섭취에 대한 pH의 영향. 각각의 값은 3반복 평균의 표준오차임
표 RsMYB1 과발현 GM페튜니아 계통(PM2, PM6, PM8)의 온실환경하에서의 세대진전(T2→T3) 및 형질 특성 관찰
표 RsMYB1 과발현 GM페튜니아 계통(TM2, TM6, TM8)에 대한 RT-PCR 분석. Actin 유전자를 반질량적(semiquantitative) 보정을 위한 대조구(internal control)로 사용하여 수행함
표 형질전환 페튜니아 T2 계통과 비형질전환체간 교잡 F1 개체에서의 안토시안닌 합성 관련 유전자의 발현양상
표 형질전환 T2 계통과 비형질전환체 간 교잡 F2 개체에서의 화색변이 양상
표 형질전환 페튜니아 T2 계통에서의 화색변이 양상 및 안토시안닌 함량비교
표 GM 페튜니아 이벤트의 생육 및 개화특성
표 PM2와 PM6 계통에서 1차 PCR 산물과 A1 primer 사이에서 증폭된 2차 PCR 산물
표 Flanking T-DNA sequencing 결과의 염기서열 분석
표 Flanking T-DNA sequencing 결과의 염기서열 분석
표 폐튜니아 잎에서 관찰된 병해충 수 평가(2020년 7-8월)
표 페튜니아 근권의 토양미생물 수 평가

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