[보고서]세균병 제어용 quorum quenching(QQ) 균주 발굴 및 이를 이용한 신개념 사료 첨가용 QQ probiotics 구축

이정기

[국가R&D연구보고서] 세균병 제어용 quorum quenching(QQ) 균주 발굴 및 이를 이용한 신개념 사료 첨가용 QQ probiotics 구축
Development of quorum quenching probiotics for prevention of bacterial disease through degradation of quorum sensing signals 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	배재대학교 PaiChai University
연구책임자	이정기
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2020-06
과제시작연도	2020
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
연구관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO202100014212
과제고유번호	1345313823
사업명	개인기초연구(교육부)(R&D)
DB 구축일자	2021-09-25
키워드	Quorum quenching.Quorum sensing.pathogenic bacteria.probiotics.antibiotics.AHL.virulence factor.biofilm.aquaculture.

초록 ▼

□ 연구개요
양식 산업에서 고질적 세균병을 제어하기 위해 항생제를 사용하고 있으나 항생제 남용에 따른 내성 균주의 출현 및 잔류 항생제 등의 많은 문제점을 가지고 있음. 본 연구에서는 동물 병원성 세균의 발병과 관련이 있는 쿼럼 센싱(Quorum Sensing) 시스템을 차단하는 쿼럼 퀜칭(Quorum Quenching, QQ) 전략을 사용하여 세균병을 억제하고자 함. 이를 위하여 QS의 신호분자인 N-acylhomoserine lactone (AHL)을 효소적으로 불활성화 시킬 수 있는 QQ 균주를 발굴하고, 발굴 균주를 항생제 대신 어병 억제를 위해 사용할 수 있는 신개념의 사료 첨가용 QQ probiotics 균주로 구축하는 것을 목표로 함.

□ 연구 목표대비 연구결과
1.양식 환경에서 자생적 AHL 분해 quorum quenching 균주의 탐색 및 분리
- 민물양식장, 서해안 지역, 횟집 양식 수조 등에서 AHL을 유일 탄소원으로 이용한 증균배양을 통해 QQ 미생물 분리 및 확보
- 국립수산과학원 광어 양식 수조의 광어 장내에서 QQ 균주 분리 확보
2. 다양한 분리 QQ 균주 및 QQ 유전자의 특성화
- 다양한 샘플로부터 분리한 다양한 QQ 균주의 AHL 분해특성 조사
- 분리 균주들로부터 신규 QQ 유전자원의 분리 확보
3. 수 환경 유래 Rhodococcus 속의 새로운 QQ 유전자원의 특성화
- 신규 AHL-lactonase 효소(JydB)의 고발현, 분리 정제, 효소적 특성 분석을 통한 QQ 효소의 기능 규명
- 신규 AHL-lactonase JydB와 기존의 QQ 효소 QsdA의 QQ 활성 비교 분석
4. 어병 억제 사료 첨가용 QQ probiotics 구축을 위한 사전 분석
- 시판 양어장용 probiotics 수집 및 QQ 활성 분석
- QQ 균주의 probiotics 적용을 위해 용혈성 조사와 같은 생물학적 안전성 조사
- QQ 균주 및 효소와 어병 균주의 co-culture 방법 등을 통한 QQ 활성에 의한 생물막 형성 억제 효과 분석완료

□ 연구개발결과의 중요성
- 본 연구 결과인 QQ 균주 및 효소는 QS 신호전달 기작을 차단하여 발병을 억제할 수 있기에 양식 사업에서 기존 항생제 사용의 새로운 대안으로 활용될 수 있음. 또한 QQ 연구 결과를 통해서 병독성 유전자의 발현만을 억제시킴으로서 가장 문제가 되고 있는 항생제 내성 균주의 출현 기회를 최소화 할 수 있고, 또한 항생제 사용량도 저감시킬 수 있는 새로운 세균병 억제 전략에 활용할 수 있음.
- 본 연구 결과는 기존의 단순 probiotics의 기능에 QQ 활성을 접목하여 새로운 기능을 추가적으로 부여함으로서 병원성 세균의 효과적 제어를 위한 신개념의 항생제 대체제 개발 연구에 응용할 수 있는 기반 연구임.
- 잠재력이 큰 quorum quenching 연구는 농축산업, 수산업, 환경 및 궁극적으로 인간을 위한 의약품 개발 까지 산업적으로 많은 응용 연구가 이루어 질 수 있음. 특히 다양한 산업 분야에서 많은 문제가 되고 있는 생물막과 biofouling(생물오염)의 문제를 해결할 수 있는 산업적 응용성 큰 핵심 기반기술이 될 수 있음.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
1) 세균의 신호전달 체계인 quorum sensing(QS) 메커니즘과 AHL에 의한 발병 유도 ... 4
2) 병원성 세균의 quorum sensing 신호전달 시스템을 차단하는 quorum quenching을 통한 신개념의 동물 세균병 억제 전략 ... 4
3) 양식 어류의 질병 내성을 증대시킬 수 있는 신개념의 사료 첨가용 quorum quenching probiotics 균주 구축 ... 4
2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 5
1) 국내 양식장 및 서해안 지역으로 부터 QQ 균주의 분리 및 동정 ... 5
2) 분리한 QQ AHL 분해 균주의 기질특이성 ... 7
3) 분리 QQ 균주의 용혈성 테스트 및 생물막 형성 억제능 조사 ... 9
4) 분리 QQ 균주로부터 새로운 QQ 유전자원 확보 ... 10
5) Rodococcus sp. BH4 유래 두 가지 type의 AHL-lactonase인 JydB와 QsdA의 고발현, 정제 및 특성화 ... 13
6) Rodococcus sp. BH4 유래 JydB와 QsdA AHL-lactonase의 정제효소 특성 비교 분석 ... 14
3. 연구개발결과의 중요성 ... 18
4. 참고문헌 ... 18
5. 연구성과 ... 21
끝페이지 ... 22

표/그림 (18)

표 국립수산과학원 시험용 양식조와 금강주변의 양식장에서 QQ 균주의 분리 및 동정
표 서해안 지역 (안면도, 대천) 및 대전 횟집의 수조에서 QQ 균주의 분리 및 동정
표 국내 양식장으로부터 분리한 QQ 균주의 기질특이성
표 서해안 지역으로부터 분리한 QQ 균주의 기질특이성
표 분리한 QQ균주의 용혈성 테스트
표 분리한 QQ 균주에 의한 생물막 형성 억제
표 양식수조의 넙치 분변에서 분리한 Dermacoccus 속 세균의 계통수 분석
표 Dermacoccus 속 유래 putative AHL-lactonase와 Rhodococcus 속 유래 AHL-lactonase (QsdA)의 아미노산 서열 상동성 분석
표 Phylogenetic analysis of JydB and other known AHL-lactonases. Sequences used for the analysis were; AhlD from Arthrobacter sp. IBN110, AiiA from Bacillus sp. A24, RmmL from Ruegeria mobilis YJ3, AiiB from Agrobacterium tumefaciens, AttM from Agrobacterium tumefaciens, AidC from Chryseobacterium sp. StRB126, MomL from Muricauda olearia, QsdA from Rhodococcus erythropolis W2, AidH from Ochrobactrum sp. T63, AiiM from Microbacterium testaceum, QsdH from Pseudoalteromonas byunsanensis, GkaP from Geobacillus kaustophilus, VmoLac from Vulcanisaeta moutnovskia, SsoPox from Sulfolobus solfataricus, Aii810 from Mao-tofu metagenome, QqlB from Paraburkholderia glathei, QqlM from Mesorhizobium ciceri, and QqlG from Geminicoccus roseus. JydB is indicated with an asterisk. The dendrogram was constructed using the neighbor-joining method with MEGA X software (http://www.megasoftware.net/). The scale bar represents 0.2 substitutions per amino acid position
표 Presence of two different type AHL-lactonases on the chromosome of Rhodococcus sp. BH4. High AHL-degrading activity of Rhodococcus sp. BH4 compared to other QQ strains may be due to the presence of multiple QQ enzymes including two types of AHL-lactonases aside from the AHL-acylase and oxidoreductase
표 Phylogenetic analysis of JydB and other known AHL-lactonases. JydB is indicated with an asterisk. The dendrogram was constructed using the neighbor-joining method with MEGA X software (http://www.megasoftware.net/). The scale bar represents 0.2 substitutions per amino acid position
표 Rhodococcus 속 유래 재조합 AHL-lactonase 효소들 (JydB, QsdA)의 고발현 및 정제
표 HPLC analysis of C6-HSL degradation by JydB and restoration of C6-HSL by acidification of JydB-hydrolysis product. A. 1mM C6-HSL substrate peak is shown as the control with an elution time of 9.5 min, which was monitored at 205 nm. B. C6-HSL hydrolysis reaction was carried out with 4.6 μg JydB and 1 mM C6-HSL at 37℃ for 15 min and terminated by boiling. The profile of the JydB-hydrolyzed C6-HSL product shows a new peak (5 min) of hydrolyzed product, whereas the C6-HSL substrate peak (9.5 min) is decreased. C. C6-HSL was restored by acidification of JydB-hydrolyzed C6-HSL product. The reaction mixture was acidified to pH 2 by adding 1N HCl and incubated at 4℃ for 24hr
표 Comparison of metal effect on the enzymatic activity of QsdA and JydB. AHL degradation efficiency of QsdA (A) and JydB (B) was measured after adding 1mM of different metal ions (Ca2+, Co2+, Mg2+, Mn2+, Ni2+, Zn2+) or EDTA to reaction mixtures
표 Comparison of AHL substrate specificity of QsdA and JydB. AHL degradation efficiency of QsdA (A) and JydB (B) was assessed using AHL substrates of different lengths (C6-C12-HSL) and 3-oxo-substitutions (OC6-OC12-HSL). Control sample contained a known concentration of C6-HSL
표 Time course analysis of QsdA and JydB activity. Six μg/ml of purified proteins were mixed with 5μM of C6-HSL, oxo-C6-HSL. Reactions were carried out at 37°C and stopped by boiling. Control sample contained a known concentration of AHLs. (A) QsdA activity against C6-HSL. (B) JydB activity against C6-HSL. (C) QsdA activity against oxo-C6HSL. (D) JydB activity against oxo-C6-HSL
표 Kinetic constants of AHL hydrolysis by JydB
표 Inhibition of biofilm development on a glass slide and a 96-well microtiter plate. (A) The biofilm-producing Aeromonas sp. T3-4 and 4.6 μg/ml purified JydB were added together, and cultivated for 24 hr with a glass slide at 30℃. (B) Purified enzyme and Aeromonas sp. T3-4 were cultivated together in a 96-well microtiter plate for 12hr. Turbidity was measured at OD600 prior the treatment with 0.1% crystal violet (black bars). Formation of biofilm was measured at OD550 (gray bars). All experiments were carried out in triplicates

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