초록 ▼

□ 연구개요
유전체교정을 통한 동물세포유전체의 선택적, 특이적 개량의 경우 산업용 동물세포주의 맞춤형 개량을 통한 고부가가치 바이오의약품의 고효율생산과 같은 산업용 가치에서부터 줄기세포, 세포치료제, 유전자치료제와 같은 재생의학 분야에 이르기까지 다양한 적용가능성을 내포하고 있음. 본 연구의 목표는 세포주기 및 DNA 수선경로를 동시에 고려하여 상동 재조합을 통한 특이적 유전체교정의 효율을 극대화시키고, 다양한 크기와 다양한 종류의 (외래) 유전자를 성공적으로 동물세포에 삽입 및 발현시킴으로써 안정적이고 예측 가능한 방향으로

□ 연구개요
유전체교정을 통한 동물세포유전체의 선택적, 특이적 개량의 경우 산업용 동물세포주의 맞춤형 개량을 통한 고부가가치 바이오의약품의 고효율생산과 같은 산업용 가치에서부터 줄기세포, 세포치료제, 유전자치료제와 같은 재생의학 분야에 이르기까지 다양한 적용가능성을 내포하고 있음. 본 연구의 목표는 세포주기 및 DNA 수선경로를 동시에 고려하여 상동 재조합을 통한 특이적 유전체교정의 효율을 극대화시키고, 다양한 크기와 다양한 종류의 (외래) 유전자를 성공적으로 동물세포에 삽입 및 발현시킴으로써 안정적이고 예측 가능한 방향으로 동물세포유전체를 설계할 수 있는 플랫폼 기술을 개발하는 것임.

□ 연구 목표대비 연구결과
1. DNA 수선경로 효율 분석을 위한 모니터링 시스템 구축
- 연구결과: Promoter trap을 활용한 위치특이적 유전자 삽입 효율 측정 세포주 구축 및 검증 완료: Promoter가 제거된 GFP 발현 카세트를 CHO, HEK세포의 특정 유전체 위치에 위치특이적으로 삽입한 promoterless 세포를 구축하였고, 해당 세포주를 대상으로 CRISPR/Cas9 및 donor plasmid를 활용하여 위치특이적 promoter 삽입시 GFP 형광이 발현되는 세포가 나타남을 확인함. CHO-K1의 경우 두 개의 독립적인 삽입 위치에서의 유전자 삽입 효율을 측정할 수 있는 double knock-in monitoring cell line을 추가로 구축하였고 부착배양, 부유배양이 가능한 버전을 확보하여 활용하고 있음.
2. DNA 수선경로 조절을 위한 타겟 유전자군 스크리닝 및 이를 이용한 상동 재조합 경로 활성화 조건 탐색 및 검증
2-1. SNP 교정 숙주세포주 구축 및 활용
2-2. Cas9 단백질 공학: 삽입 효율 극대화를 위해서 Cas9과 donor DNA의 물리적인 결합을 시도하여 유전체 부위 절단과 공여 DNA의 공간학적 동기화를 시도함.
2-3. 최적화된 donor 디자인 구축: 목표로 하는 유전체 삽입위치를 타겟팅하는 sgRNA target site를 donor plasmid에 접목시킨 double cut donor를 활용하여 유전자 삽입 효율을 2.9-36배 증대시킴
2-4. 세포주기 조절을 통한 knock-in 효율 증대 방법론 구축:저농도 히드록시우레아 (Hydroxyurea)를 활용하여 간단하게 위치특이적 유전자 삽입에 유리한 S기로 세포주기를 조절하는 방법을 개발하여 knock-in 효율 증대효과를 거둠.
3. 최적화된 조건을 이용한 위치특이적 복수 외래 유전자 삽입 및 효율 측정
- 연구결과: 두 가지 다른 유전체 위치에 동시다발적으로 유전자 삽입을 시도하였고 세포 타입 및 유전자 삽입 위치에 따른 효율을 측정 및 비교 분석하였음.

□ 연구발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성)
해당 연구결과는 산업용 동물세포주의 맞춤형 개량을 위한 기반기술로 활용 가능함. CHO세포를 포함하는 동물세포주를 이용한 생산플랫폼이 바이오의약품 생산의 약 60%를 차지하고 있는 현 상황에서 산업용 동물세포주를 개량하여 저비용/고효율의 바이오의약품 생산공정을 구축하는 것은 필수적이고 본 연구결과가 이러한 새로운 플랫폼을 구축하는데 기여할 수 있을 것이라 사료됨. 비단 바이오의약품 생산뿐만 아니라 새로운 대사 및 신호전달경로의 위치특이적 삽입 및 분석을 통해 동물세포의 대사 및 유전공학분야의 발전에 기여를 할 수 있음. 특히 줄기세포와 같이 복잡한 전자 조절 네트워크의 이해가 필요한 분야에서 균일하고 조절 가능한 전사조절 인자들의 발현을 통해 줄기세포의 만능분화능 및 유지/증식에 관련된 분자 네트워크 로드맵을 제시하고 작용기작을 이해하는 데 플랫폼 기술로서 사용될 수 있을 것으로 기대함.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 3
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 4
• 1-1. 연구의 목표 및 내용 ... 4
• 1-2. 연구의 필요성 ... 4
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 7
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 8
• 4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 12
• 5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 13
• 6. 참고문헌 ... 13
• 붙임1. 세부 정량적 연구개발성과 ... 16
• 붙임2. 연구책임자 대표적 연구실적 및 증빙(요약문 및 사본) ... 27
• 끝페이지 ... 41