[보고서]종양 유발 인산화 효소를 표적하는 환자 맞춤형 단백질 치료제 개발

김학성

보고서 정보

주관연구기관

한국과학기술원
Korea Advanced Institute of Science and Technology

연구책임자

김학성

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2020-12

과제시작연도

2019

주관부처

과학기술정보통신부
Ministry of Science and ICT

등록번호

TRKO202100021466

과제고유번호

1711087438

사업명

집단연구지원(R&D)

DB 구축일자

2022-04-09

키워드

인산화효소.계산적 방법.단백질 약물 전달.암.약물 저항성.작용기작.단백질 치료제.활성조절 도메인.특이성.Oncogenic kinase.Therapeutic proteins.Regulatory domain.Cancer.Drug resistance.Protein delivery.Mode of action.Specificity.Computational method.

표 각 종양 유발 인산화효소의 allosteric regulatory 도메인 발현 형태
표 라이브러리 구축을 위해 NNK 코돈으로 치환된 리피바디의 모듈 (노란색)
표 Btk의 SH2에 결합하는 리피바디 선별을 위한 phage ELISA
표 BTK의 SH2 도메인에 결합하는 리피바디들의 아미노산 서열
표 Lck의 SH2 도메인에 결합하는 리피바디 선별을 위한 phage ELISA
표 Lck의 SH2 도메인에 결합하는 리피바디들의 아미노산 서열
표 PI3K의 nSH2에 결합하는 리피바디 선별을 위한 phage ELISA
표 PI3K의 nSH2 에 결합하는 4개의 리피바디 클론의 아미노산 서열
표 박테리아 독소 단백질 기반 전달 시스템
표 박테리아 독소 기반 세포 내 단백질 전달 시스템을 이용한 형광 단백질의 전달
표 세포 내 단백질 전달 시스템 농도에 따른 형광세기 변화
표 Btk의 SH2에 특이적인 B5 클론을 기반으로 첫번째 결합력 증대를 통해 확보한 리피바디들의 아미노산 서열
표 F10 리피바디의 정제
표 최종 개발된 F10 리피바디의 SPR을 이용한 결합력 측정
표 PI3K의 nSH2 도메인에 결합하는 리피바디로부터 결합력이 증대된 리피바디들의 아미노산 서열
표 최종 선별된 리피바디 (E9)의 결합력을 ITC 측정 결과
표 Lck의 SH2 도메인에 결합하는 리피바디 G8 클론으로부터 결합력이 증대된 리피바디 클론
표 Lck의 SH2 도메인에 대한 결합력이 증대된 리피바디 서열
표 등온 적정 열량 측정법을 통한 Lck SH2 도메인과 선별된 리피바디들 사이의 결합 친화도 측정. (a) G8 클론 (b) A4 클론 (c) B9 클론 (d) D3 클론
표 Lck의 SH2 도메인을 표적하는 리피바디들의 결합력
표 F10 리피바디의 SH2 도메인에 대한 특이성
표 PI3K의 nSH2 에 특이적인 리피바디 클론의 교차반응성
표 최종 클론으로 선정된 E9 클론을 대장균에서 발현한 결과 (1: 사이즈 마커, 2: Induction 전, 3: Induction 후, 4: 수용성 부분, 5: 비수용성 부분, 6: 친화 크로마토그래피 Flow-Through, 7: Washing, 8: Elution, 9: GPC 후 단백질 농축)
표 선정된 G8 클론의 다른 인산화효소의 SH2 도메인에 대한 교차 반응성
표 선별된 리피바디 클론들이 Lck의 SH2 도메인에 대한 특이성
표 Src 패밀리 인산화효소들에 대한 리피바디의 교차 결합 여부 확인
표 대장균 균주에서 발현한 리피바디를 친화성 크로마토그래피를 통해 정제. (a) G8 클론 (b) A4 클론 (c) B9 클론 (d) D3 클론
표 세포 내 단백질 전달 시스템을 이용한 루시퍼라아제 전달
표 세포 내 단백질 전달 시스템을 이용한 신호 전달 체계 물질 전달
표 세포 내 단백질 전달 시스템을 이용한 암 세포 성장 억제
표 세포 침투 펩타이드와 F10 리피바디의 융합 유전자를 구축 및 대장균에서의 발현과 정제
표 금 나노입자와 Zinc-finger를 이용하여 개발된 단백질 전달 시스템
표 금 나노 입자와 Zinc-finger로 제작된 구조체의 TEM 영상
표 금 나노 입자를 기반 단백질 전달 시스템을 이용한 동물 모델에서의 암 성장 억제
표 컴퓨터 모델링을 통해 얻어진 Btk kinase의 SH2-KD의 구조 모델. (노란색: SH2, 파란색: kinase domain, 회색: linker)
표 컴퓨터를 이용한 Btk의 SH2 도메인에 결합하는 리피바디의 결합 부위 예측 구조. 예측된 3 결합 부위 (M1, M2, M3) 중에서 M1 부위에 결합하는 것으로 예측됨. 하늘색 아미노산은 SH2-M1, 녹색은 SH2-M2, 분홍색은 SH2-M3임
표 예측된 3 부위의 돌연변이에 의한 리피바디의SH2 도메인 대한 결합력 변화
표 Btk의 SH2-KD 도메인의 SAXS data 및 ab initio 구조 피팅 모델. A: SAXS 데이터의 실험 결과 (dots) 와 Btk의 단위 구조들의 계산된 피팅 그래프. B. Btk의 단위 구조체들의 pair-distribution constructs. C: 서로 다른 구조체들의 분석 및 결과 요약. D: Btk의 KD 도메인의 3차원 구조 (1K2P)에 모델 KD 도메인의 Ab initio 재구성. E: MD 시뮬레이션 결과로부터 얻어진 가장 높은 해상도의 피팅 모델과 SH2-KD 도메인의 Ab initio 재구성. F: SH2-KD도메인의 아미노산 모델 구조. G: MD 시뮬레이션으로부터 얻어진 상위 6개의 피팅 모델과 함께 SAXS의 초기 결과 그래프
표 Lck의 SH2 도메인에 결합하는 리피바디의 결합부위 예측을 위해 설계된 다섯 종류의 SH2 도메인 돌연변이들의 위치
표 다섯 종류의 Lck SH2 도메인 돌연변이(D1-D5)에 대한 A4와 D3 리피바디의 결합력 측정. D1, D2, D3, 그리고 D5에 대한 결합력은 변화가 없는 반면 D4 부위에 대해서는 결합력을 상실함. (a) Lck SH2 도메인의 D1, D2, D3 돌연변이에 대한 결합력 측정 (b) Lck SH2 도메인의 D4, D5 돌연변이에 대한 결합력 측정
표 리피바디의 PI3K에 대한 결합 부위 예측을 위해 인산화 타이로신 펩타이드 서열 (pY751, pY740)과의 경쟁적 결합 실험. F1 및 E9 리피바디 모두 농도 증가에 따라 경쟁이 강해지는 것을 확인하였으며 결합력 증대된 E9 클론이 경쟁이 더 강한 것을 바탕으로 같은 위치에 결합하는 것을 확인함
표 계산적 방법으로 예측된 E9 리피바디의 nSH2 도메인에의 결합 부위. 두개의 결합 부위 예측 모델이 설계되었으며 전체 효소 구조에서 SH2 도메인이 kinase 도메인과 상호작용하는 부위로 확인됨
표 설계된 각각의 SH2 돌연변이에 대한 E9 리피바디의 결합 여부 확인. 두 결합 부위에 모두 결합하지 못하므로 두 모델에 걸쳐서 결합하는 것으로 예측됨
표 PI3K 전효소에 대한 결합력 측정 결과. 초기 선별된 클론들로 실험한 결과 모든 클론들이 SH2 도메인 대비 7배 낮은 수준으로 결합하는 것으로 확인됨
표 F10 리피바디의 Btk 자가 인산화 활성 저해 효과
표 F10 리피바디의 Btk 기질 인산화 활성 저해 효과
표 리피바디 A4와 D3가 Lck의 자가 인산화(왼쪽) 및 기질 인산화 활성(오른쪽)에 미치는 영향. 대조군으로 실험한 imatinib에 대비하여 유의미한 효과를 나타내지 못함
표 리피바디의 PI3K 인산화기능 억제 효율을 분석한 결과. 실험은 ATP를 마지막에 쳐준 co-treat 그룹과 미리 5분간의 사전 자체적 인산화 반응을 진행한 pre-phosphorylation 그룹으로 나누어 진행함. 사전 자체적 인산화를 진행한 결과 PI3K의 기질 인산화 반응이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며 리피바디는 co-treat 그룹에서 기질 인산화를 증대시키는 것을 확인함
표 상피 성장 인자 수용체에 결합하는 리피바디
표 상피 성장 인자 수용체에 결합하는 리피바디의 특이성 확인
표 표적 단백질과의 결합 여부 확인을 위한 실험 방법
표 리피바디와 SH2 도메인과의 결합 여부
표 정제된 TP-10 및 myc와 융합된 리피바디
표 웨스턴 블롯을 통한 세포 침투 펩타이드가 융합된 리피바디의 세포 내 전달 확인
표 이미징을 통한 세포 침투 펩타이드가 융합 리피바디의 세포 내 전달 확인
표 세포 생존 정도 (cell viability %) 확인
표 세포 내에서 리피바디와 Btk와의 결합 여부 확인
표 TAT을 이용하여 세포 내로 전달된 리피바디가 Btk의 자가 활성 부위인 티로신223에 미치는 영향
표 Btk와 리피바디의 발현 벡터 구축
표 HEK293 세포에서의 최종 확보한 리피바디 (F10)과 Btk의 발현 확인
표 HEK293 세포에서 Btk kinase와 rF10 리피바디의 결합 여부 확인
표 F10 리피바디를 처리하였을 때 Btk kinase의 auto-phosphorylation 티로신 223의 변화
표 F10 리피바디를 처리하였을 때 Btk kinase의 auto-phosphorylation인 티로신223번의 변화를 그래프화 한 결과
표 F10 리피바디를 처리하였을 때 약물 저항성 돌연변이가 유발된 Btk의 auto-phosphorylation 억제 효과 결과 (A) Btk(C481S) (B) Btk(C481R) (C) Btk(T474I) 의 auto-phosphorylation 변화
표 동시면역침강법을 통한 A4, D3 리피바디의 Lck와의 세포 내 결합 여부 확인. Lysate로 표시된 그룹은 각 단백질의 세포내 발현량을 확인한 것이고 IP로 표시된 그룹은 myc 표지된 리피바디를 myc표지 항체로 면역 침강반응하여 결합력을 확인한 결과임. (Mock: 리피바디가 들어가지 않은 벡터 형질주입, WT: Lck에 결합하지 않는 야생형 리피바디 형질주입, A4,D3: 개발된 A4, D3 리피바디 형질주입), (Myc: Myc표지된 리피바디, β-actin: 전체 샘플양이 동일한지 확인하기 위한 대조군, Lck: Lck의 발현량 및 동시면역침강여부 확인)
표 개발된 리피바디 A4와 D3가 세포내에서 Lck의 활성을 변화시킬 수 있는지 확인한 실험. Myc은 myc 태그로 표지된 리피바디의 발현, Lck는 Lck kinase의 발현을 확인한 것임. 505pY는 Lck의 기능을 억제시키는 505번 타이로신의 인산화 정도이고, 394pY는 Lck의 기능을 활성화시키는 394번 타이로신의 인산화 정도임. β-actin은 전체 샘플양이 동일한지 확인하기 위한 대조군. (Mock: 리피바디가 들어가지 않은 벡터 형질주입, WT: Lck에 결합하지 않는 야생형 리피바디 형질주입, A4, D3: 개발된 각 A4, D3 리피바디 형질주입)
표 E9 리피바디의 세포 내에서의 PI3K 활성 저해 분석. PI3K의 하위 신호전달 단백질로 대표되는 Akt의 인산화 여부를 분석한 결과 저분자 저해제 wortmannin에 비하여 E9 리피바디는 PI3K 활성 저해 효과가 없는 것으로 확인됨. (Control: PBS처리, Wort: wortmannin 처리, Mock: 리피바디가 없는 벡터 형질주입, WT: PI3K에 결합하지 않는 리피바디 형질주입, E9: 개발된 E9 리피바디 형질주입), (Myc tag: Myc 표지된 리피바디의 발현 확인, β-actin: 전체 샘플양이 동일한지 확인하기 위한 대조군, tAKT: 전체 Akt 발현량 확인, pAKT: Akt 인산화 정도 확인)
표 세포 내에서 E9 리피바디와 PI3K의 결합 유지 여부 분석. Lysate 군은 세포 내에서 발현량을 western blot으로 확인. IP로 표시된 면역침강반응 그룹에서는 리피바디는 잘 확인되었으나 PI3K는 매우 약한 수준으로 결합함. (Mock: 리피바디가 없는 벡터의 형질주입, WT: PI3K에 결합하지 않는 리피바디 형질주입, E9: 개발된 E9 리피바디 형질주입), (Myc tag: Myc 표지된 리피바디의 발현 확인, β-actin: 전체 샘플양이 동일한지 확인하기 위한 대조군, p85: 리피바디가 결합하는 PI3K의 nSH2 도메인)
표 ibrutinib 저항성 돌연변이를 포함한 Btk의 SH2-KD 도메인의 발현 및 정제
표 효소결합 면역분석법 (ELISA)를 이용한 정제된 돌연변이 단백질과 rF10의 결합 여부 측정
표 rF10과 ibrutinib의 농도를 100 nM, 250 nM, 500 nM로 처리하였을 때, 약물 저항성 돌연변이인 C481S, C481R, C481Y, T474I를 포함한 Btk의 SH2-KD의 활성 측정 결과
표 rF10과 ibrutinib의 농도를 62.5 nM부터 2000 nM까지 세분화하여 처리하였을 때, wild-type과 C481S, T474I를 포함한 Btk의 SH2-KD의 활성 측정 결과
표 C481S를 포함하는 Btk의 전체 서열과 N-terminal에 myc-tag을 추가한 rF10 혹은 wild-type 리피바디를 HEK293 세포에 transfection후, western blot을 이용하여 Btk의 인산화 정도를 검출한 결과. 오른쪽 그래프는 세 번 이상의 반복 실험 수행 후, ImageJ 소프트웨어를 이용하여 티로신 223번과 티로신 551번의 인산화 정도를 수치화한 후 그래프를 그린 결과
표 T474I를 포함하는 Btk의 전체 서열과 N-terminal에 myc-tag을 추가한 rF10 혹은 wild-type 리피바디를 HEK293 세포에 transfection후, western blot을 이용하여 Btk의 인산화 정도를 검출한 결과. 오른쪽 그래프는 세 번 이상의 반복 실험 수행 후, ImageJ 소프트웨어를 이용하여 티로신 223번과 티로신 551번의 인산화 정도를 수치화한 후 그래프를 그린 결과
표 세포 침투 펩타이드와 박테리아 단백질을 이용한 세포 내 리피바디 전달 시스템
표 대장균에서의 세포 침투 펩타이드 및 박테리아 독소 기반 전달 단백질과 융합된 F10의 발현 및 정제
표 이미징을 통한 새로운 단백질 전달 시스템 기반 리피바디의 세포 내 전달 확인
표 세포 생존 정도 (cell viability %) 비교
표 리피바디와 표적 단백질 간 병진운동 조정을 위한 rosetta_scripts에 활용된 변수 조건
표 ClusPro docking 구조 및 이를 rosetta_scripts를 이용하여 추가 조정한 도킹 모델. ClusPro 도킹 구조는 하늘색으로 나타나 있으며 대표적으로 3개의 추가 조정 모델이 나타나 있음. 각각 A) IL6, B) Egfr C) C5a, D) rac1 과의 도킹 구조를 나타내고 있음
표 각 표적 단백질에 대한 X-ray 결정 구조 (연녹색), ClusPro 도킹 구조 간소화 (하늘색), Rosetta_scripts 보정 구조 간소화 (보라색)을 X-ray 결정 구조의 표적 단백질에 대해 정리한 그림. 각각 A) IL6, B) Egfr C) C5a, D) rac1 과 해당 리피바디의 구조를 나타내고 있음
표 각 표적 단백질의 X-ray 결정 구조와 ClusPro 도킹 모델, Rosetta_scripts 도킹 모델의 예측 정확도를 수치상으로 비교한 도표
표 다양한 표적 단백질과 해당 리피바디의 결합을 계산적으로 예측한 에너지 점수와 실험적으로 측정된 결합력 간의 상관계수 표
표 각 표적 단백질에 대한 ClusPro 도킹 예측 구조와 X-ray 결정 구조 간 RMSD와 BuildModel 점수 간의 상관관계 표
표 각 리피바디의 서열적 유사성을 나타내는 계통도
표 서열적 유사성을 바탕으로 선별한 18개의 리피바디의 결합력 실험 결과
표 결합력을 바탕으로 선별한 7개 리피바디의 변이 서열
표 프롤린의 유무에 따른 리피바디 구조의 차이
표 EOS를 바탕으로 예측한 리피바디 세트의 결합 구획
표 실험적으로 확인한 리피바디 세트의 결합 구획
표 A4 리피바디와 같은 구획으로 확인된 B3, B10 리피바디의 구조를 비교한 결과
표 결합 구획화 방법론의 작동기작을 증명하기 위해 제작한 돌연변이 목록
표 제작한 돌연변이에 대한 경쟁적 결합 예측 및 실험 결과의 상관성
표 EpiScope를 통해 확인한 각 리피바디의 결합 부위
표 최종 확립된 세포 내 전달 가능한 rF10 단백질 디자인
표 Ramos 세포에서의 세포 독성 평가
표 B 악성 종양 세포에서의 독성 평가
표 Btk 관련 신호 전달 체계
표 B 악성 종양 세포에서의 Btk 자가 인산화 정도 분석
표 B 악성 종양 세포에서의 Btk 인산화 및 하위 조절자의 인산화 정도 분석
표 Overview of the methodology used to bin IL6-binding repebody clones by Epibin. (a).Top panel: Sequences of IL6-binding repebody clones were obtained from a phage-display library as described previously (cite publication). Bottom panel: Partial sequences of the seven repebodies. The hypervariable sites on Module 3 and 4 are highlighted within the boxes. (b) Superposition of the two sets of modelled repebodies, highlighting conformational differences. (c) Epibin takes as input all docked models and extracts epitope residues on IL6 making contacts with residues on the repebody. For every pair of docked models, the number of epitope residues common to both models is calculated and represented as a score, termed the "epitope overlap score (EOS)". The EOS values range between 0 and 1, with 0 indicating no common epitope residues and 1 denoting all epitope residues common to both models. This process of estimating the epitope overlap score for all pair of docked models is repeated for every non-redundant pair of repebodies. Epibin then calculates the percentage of competition between two repebodies based on the number of docked models having an epitope overlap score above a user-specified threshold value and returns these predicted values of competition between all repebodies as a matrix
표 Epibin-based binning and competitive immunoassays both reveal competition between repebodies A4 and B10. (a). Binning of repebodies based on. (i). pairwise sequence identity. (ii). pairwise structural similarity as measured by C RMSD. (iii). competition predicted by Epibin with an EOS threshold of 0.8. (iv).competitive immunoassays. (b). Dendograms showing clustering of repebodies based on (i). sequence identity. (ii). structural similarity. (iii). Epibin-predicted competition. (iv). competitive immunoassays
표 Competition between A4 and B10 is attributed to presence of similar amino acids in equivalent positions. (a). Superposition of A4 and B10 structural models, illustrating structural equivalent positions in both repebodies (i). Full view. (ii). Zoomed-in view of Modules 3 and 4. Hypervariable sites 1, 2 and 3 are represented as sticks. (iii). Front view. (iv). Side-view illustrating the positions of similar amino acids in structurally-equivalent positions of A4 and B10. (b). Amino acids present in these positions in each repebody highlighting the similarity of position pairs B and D (denoted by asterisks) in A4 and B10. Superposition of C6 and (c). B10 and (d). A4
표 Rational design of repebody single-point and double-point mutants to investigate the contribution of the specified amino acids to binding affinity and specificity
표 Competitive immunoassays and ITC results confirm significance of position pair. (a). Scatter comparing Epibin-predicted competition (x-axis) and corresponding observed competition (y-axis) of all designed variants with the wild type forms of (i). A4 (ii). B10 and (iii). C6. (b). Binding affinity estimation of the wild type and variant forms of A4, B10 and C6 to IL-6 as measured by isothermal titration calorimetry
표 Epitopes of A4 and B10 partially overlap with each other. Episcope was used for designing triple-mutant variants of IL6 to pinpoint epitope locations for six repebodies. Each of these variants, targeting different residues on IL6, were tested for binding to the repebodies. (a). Epitope residues corresponding to the triple-mutant designs mapped onto the structure of IL6 (PDB ID: 1ALU). The residues are assigned into each of the three color groups based on their location in the structure (b). Bar plots representing the binding of wild-type IL6 and its variants to each of the six repebodies. Values are mean+S.D of three replicates

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