보고서 정보
주관연구기관 |
의약바이오컨버젼스연구단 |
연구책임자 |
김성훈
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2020-06 |
주관부처 |
(범부처사업) NTIS |
등록번호 |
TRKO202200001331 |
DB 구축일자 |
2022-05-28
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키워드 |
섬유화.면역세포 이동.폐동맥고혈압.세포주개발.인간 단클론항체.염증.Fibrosis.immune cell migration.pulmonary arterial hypertension.stable cell line development.human monoclonal antibody.inflammation.
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초록
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IV. 연구개발결과
(1) 생산 세포주 구축 및 공정 개발 연구
○ 세포주 구축 및 세포주 안정성 테스트
- 후보항체 1종 N3-8에 대해 top 5 clone RCB (research cell bank)를 확보하였고 각각 25 vials/clone 뱅킹완료. 5 clone에 대한 single cell imaging 및 60 generation 계대배양 안정성 (viability, productivity)을 확인하였으며 모두 acceptance criteria >70% 기준을 충족시켰음. Mycoplasma cont
IV. 연구개발결과
(1) 생산 세포주 구축 및 공정 개발 연구
○ 세포주 구축 및 세포주 안정성 테스트
- 후보항체 1종 N3-8에 대해 top 5 clone RCB (research cell bank)를 확보하였고 각각 25 vials/clone 뱅킹완료. 5 clone에 대한 single cell imaging 및 60 generation 계대배양 안정성 (viability, productivity)을 확인하였으며 모두 acceptance criteria >70% 기준을 충족시켰음. Mycoplasma contamination 및 TSE/BSE viral risk 없음을 확인함
○ USP 및 DSP 개발
- N3-8 항체에 대한 USP, DSP 구축 완료. Growth profile, nutrition metabolic rate profile, titer에 기반한 성장 모니터를 수행하였음. 2L 규모 3배치 최적 배양 조건 재현성을 시험하였으며 평균 5g/L의 생산성을 확인함. USP verification run에서 시험 오차율은 2% 내외로 확인 됨
- 3단계 컬럼 정제 (PA, CEX, MMX)과정과 filtering을 포함한 정제 공정 개발을 완료하 였음. 정제 수율 평균 64.7%, 순도 97.8% 달성. DSP 최종 산출물에 대해 SEC, CE-SDS (NR), CEX, cIEF, glycan profile 분석법으로 항체 품질 확인
(2) 폐동맥 고혈압 환자에서의 임상적 검증
○ 8명의 폐동맥 고혈압 (PAH) 환자 조직을 확보하여 이중 6인의 폐 엽 11 샘플과 non-PAH 조직 4 샘플을 분석하였음. 그 결과 PAH 환자에서 유의적으로 높은 monocyte/macrophage 수와 KRS의 유의적으로 높은 발현을 확인하였음. 세포막 KRS는 증가된 경향성을 보였음
(3) 폐동맥 고혈압 모델에서의 후보항체 효력 시험
○ MCT (monocrotaline) 모델 및 hypoxia 모델에서의 효능 시험
- N3-8-1 항체로 MCT 모델 효능 시험을 진행하였으나 유의한 효능이 확인되지 않음. 이에 N3-8-1과 CDR, 항체 물성, in vitro 효능 등 모든 면에서 유사한 N3-8 항체로 변경 하고 이후의 실험은 N3-8로 진행하기로 범부처와 협의. N3-8 항체는 RVESP (right ventricular end-systolic pressure), Fulton index, medial wall thickness등 여러 항목에서 통계적 유의성이 기 확보되어 있는 항체임. 재현성 확인 시험에서 in vivo 효능 확인 완료
○ MCT 모델 병용 투여 시험
- N3-8 항체 0.5 mpk를 standard care 약물인 sildenafil과 병용투여 수행. 그 결과 우수한 survival 및 RVESP 개선 효과를 확인하였음
○ Hypoxia 모델에서의 효능 시험
- N3-8 항체의 효능을 hypoxia model에서 검증. 0.1 mpk, 1 mpk 처리에서 유의한 systolic pulmonary pressure, diastolic pulmonary pressure, mean pulmonary pressure, right ventricular systolic pressure의 감소를 확인하였음
○ In vivo에서의 세포 이동 저해
- N3-8 항체의 면역세포 이동 저해를 in vivo LPS 급성 폐손상 모델에서 intravital imaging 기법을 통해 확인함. 항체 처리는 단핵구/대식세포의 혈관 extravasation을 70% 정도 감소시켰으며 단핵구/대식세포의 폐조직 침윤을 유의적으로 억제하였음
○ In vitro 효력 시험
- Laminin421 존재 하에 단핵구/대식세포의 세포 이동이 높게 유도됨을 확인하였으며 N3-8 항체 처리에 의해 단핵구/대식세포의 세포이동성이 basal 수준 (>90 %) 으로 억제함을 확인하였음
(4) 예비독성 시험
○ Rat 단회 독성 시험 및 2주 DRF 시험 (non-GLP)
- N3-8-1 항체를 rat에 4, 20, 100 mpk 처리 하여 단회 독성 시험 확인. 그 결과 특이 증상, 폐사 및 육안 소견이 관찰되지 않음
- N3-8 항체를 rat에 10, 30, 100 mpk 주 2회 2주간 반복 처리하여 독성 확인. 그 결과 특이 증상, 폐사, 육안 소견, 혈액분석 소견 및 조직병리학적 이상이 관찰되지 않음
○ Monkey DES 시험 (non-GLP)
- N3-8 항체를 monkey에 10, 30, 100 mpk 주 1회 3주간 반복 처리하여 독성 확인. 그 결과 특이적 임상증상은 없었으며, 안검사, 뇨검사, 혈액검사 및 조직 병리검사에서도 특이적인 이상은 관찰되지 않음
(5) DMPK 연구
○ Bio-distribution 연구
- 표적 단백질을 세포막에 발현하는 암세포 Hepa1.6를 마우스에 이식 후 N3-8 항체의 항원 인식 및 체내 분포를 확인. N3-8 항체는 투여 초반엔 혈관을 따라 전신적으로 분포하였으며 시간이 지나면서 표적 단백질이 존재하는 암조직 주변에 높게 분포 (대조군 대비 > 1.5배). 또한 혈액 및 면역세포가 풍부한 간 조직에도 높은 분포를 보임
○ Rat PK (3 dose) 및 monkey PK (single dose)
- Rat에 N3-8 항체 3 농도 (0.1, 1, 10 mpk)를 처리하여 dose에 따른 lineaUty를 확인하였음. 1 mpk에서 반감기 7일 이상의 우수한 PK parameter 확보
- Monkey에 N3-8 항체 10 mpk 처리하여 PK 확인. Rat에서와 유사하게 우수한 PK parameter 확보
(6) 기전연구 및 분석법 개발
○ 자사 분석법 개발
- 흡광도계를 이용한 정량, SDS-PAGE, ELISA, SPR, cell migration 5 종의 자사 분석법을 개발하였음. 모두 6반복 수행하였으며 설정 목표인 80~120% 와 동일하거나 더 엄격한 기준을 충족함
○ 임상샘플 적용을 위한 마우스폼 항체 구축
- Mouse IgG2a/lambda chain을 가진 N3-9 항체 유전자를 구축하였으며 52.2 mg 항체 생산을 완료함. 추가적으로 mouse IgG2a/kappa chain 및 Rabbit N3-9 항체도 생산하였음
○ IHC 프로토콜 확립
- Mouse IgG2a/lambda-N3-9, mouse IgG2a/kappa-N3-9, Rabbit N3-9 3종 항체에 대한 IHC 프로토콜 확립 (Ventana 자동화 혹은 manual) 및 조직 분석에 활용
○ 면역세포 조절 기전 연구
- 항체의 기전과 효능 관련 epitope mapping, 결합력 분석, 구조 분석, intemalization 유도, cytokine 조절, 환자 PBMC에서의 KRS 발현 등을 밝혔으며 manuscript를 Immunity 저널 (IF: 21.5)에 투고완료
(출처 : 요약문 5p)
Abstract
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Human monoclonal antibody N3-8 developed by Medicinal Bioconvergence Research Center has novel MOA to inhibit monocyte/macrophage migration specifically. N3-8 and its derivative antibodies are effective in fibrotic diseases such as pulmonary arterial hypertension (PAH), where monocyte/macrophage inf
Human monoclonal antibody N3-8 developed by Medicinal Bioconvergence Research Center has novel MOA to inhibit monocyte/macrophage migration specifically. N3-8 and its derivative antibodies are effective in fibrotic diseases such as pulmonary arterial hypertension (PAH), where monocyte/macrophage infiltration is known as one of the main causes of illness. PAH has a poor prognosis with a 3-year survival rate of less than 50%.
However, there are no drugs with low side effects while increasing survival and removing the cause of PAH, implying that there is a high unmet medical need. This study aims to validate the antibody efficacy as a first-in-class therapeutics for PAH and to develop stable cell line and upstream and downstream processes for the preparation of pre-clinical study.
We developed stable cell line and upstream process (USP) and downstream process (DSP) and acquired 5 top RCBs (research cell bank) which meet the 60-generation stability criteria over 70%. USP and DSP have been set up with monitoring of growth and nutrition metabolic rate profiles and titer. The results of verification run revealed average 5 g/L of productivity in USP and the overall yield and purify of DSP were 64.7% and 97.8%, respectively. We investigated the stastically significant in vivo efficacy in MCT- and hypoxia-rat models and found that N3-8 antibody was synergistic when treated with combination with current standard care therapy. There was no toxicity observed in rat (single dose and 2-week repeated dose tox study) and monkey (3-week tox study) even at 100 mg/kg treatment and N3-8 had good pharmacokinetics parameters comparable to commercial therapeutic antibodies. N3-8 significantly inhibited monocyte migration in vitro and in vivo and we developed 5 assays to analyze the physicochemical properties and mechanism based efficacy of N3-8 with strict criteria. We also developed mouse form N3-9 antibody and immunohistochemistry protocol. Finally we submitted a paper about the immune-modulating function of N3-8 to Immunity journal (IF: 21.5). All these results suggests that we sincerely performed all the research and satisfied the goals we had proposed at the time of research proposal.
(source: Summary 8p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제 출 문 ... 2
- 보고서 요약서 ... 3
- 요 약 문 ... 4
- SUMMARY ... 8
- CONTENTS ... 9
- 목차 ... 10
- 제1장 연구개발과제의 개요 ... 11
- 1절. 연구개발의 목적 및 필요성 ... 11
- 2절. 연구개발의 범위 ... 17
- 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 18
- 1절. 국내 관련 분야 기술 개발 현황 ... 18
- 2절. 국외 관련 분야 기술 개발 현황 ... 18
- 3절. 본 연구가 국내외 기술개발현황에서 차지하는 위치 ... 19
- 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 19
- 1절. 세부 연구 목표 및 마일스톤 ... 19
- 2절. 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 20
- 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 57
- 1절. 마일스톤 평가기준 ... 57
- 2절. 마일스톤 달성도 ... 58
- 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 60
- 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 60
- 제7장 연구시설·장비 현황 ... 60
- 제8장 참고문헌 및 증빙 자료 ... 60
- 끝페이지 ... 62
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