[보고서]혈액기반 생체 검사를 위한 고민감도 표적 유전자 선별 키트 개발

박희경

보고서 정보

주관연구기관

(주)시선바이오머티리얼스

연구책임자

박희경

참여연구자

박재진 , 김형용 , 강진형 , 김완섭

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2019-04

과제시작연도

2018

주관부처

산업통상자원부
Ministry of Trade, Industry and Energy

등록번호

TRKO202200006609

과제고유번호

1415156727

사업명

포스트게놈신산업육성을위한다부처유전체사업(R&D)(산업부)

DB 구축일자

2022-08-27

키워드

표적유전자 선별.유전자 캡쳐.액체생검.고민감도.차세대염기서열분석장치.

표 침습적 샘플링2)의 대체가 가능한 혈액을 사용한 동반진단 키트
표 최종 개발 시스템 및 세부 개발 기술
표 혈액을 이용한 생검의 장점
표 영국 내 생검 중 발생한 합병증과 그 비율
표 진행성 폐암의 임상연구들에서 분석 가능한 종양검체 획득률 (Soria JC.ASCO 2008. Discussion session)
표 암의 heterogeneity 형태 (Burrell, Rebecca A., et al. "The causes and consequences of genetic heterogeneity in cancer evolution." Nature 501.7467 (2013): 338-345.)
표 혈액내 존재하는 암 유래 유전자의 생성 원리 (Schwarzenbach, Heidi, Dave SB Hoon, and Klaus Pantel. "Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients." Nature Reviews Cancer 11.6 (2011): 426-437.)
표 동반진단 및 맞춤형 치료제 관련 패러다임의 변화
표 동반진단의 대상 유전자 변이에 따른 맞춤형 치료제의
표 혈액내 존재하는 암 유래 유전자 모니터링을 통한 치료방향 설정 (Roschewski, Mark, Louis M. Staudt, and Wyndham H. Wilson. "Dynamic monitoring of circulating tumor DNA in non-Hodgkin lymphoma." Blood (2016): blood-2016.)
표 혈액 내 표적항암제 내성 관련 유전자변이의 주기적인 모니터링 및 치료의 전환을 통한 암의 만성질환화 (Beck, Stephan, and Tony Ng. Genome medicine 6.5 (2014): 1.)
표 대표적인 genotyping8) 기술의 성능비교, *개발예정기술 임의 반영 (International Journal of Plant Genomics. 2012. Article ID 831460)
표 국내 암 진단 개발 기업 현황
표 해외 암 진단 기술 개발 기업 현황
표 FDA 승인을 받은 혈액내 EGFR 유전자 돌연변이 진단 제품의 분석 절차 (로슈 cobas® EGFR Mutation Test v2 제품 홈페이지, http://egfrmutationtestv2.roche.com/benefits/)
표 국내 주요 NGS 염기서열 분석 기업
표 국외 주요 Cancer 관련 돌연변이 검출 제품 (Onco Panel) 및 서비스 기업
표 대표적인 표적유전자 선별 제품의 실험 절차 (Samorodnitsky, Eric, et al. "Comparison of custom capture for targeted next-generation DNA sequencing." The Journal of Molecular Diagnostics 17.1 (2015): 64-75.)
표 Bioanalyzer를 사용하여 혈액에서 추출된 cfDNA의 사이즈별 분포 정도 분석결과 150bp에서 200bp 사이에 형성되는 것을 확인하였음, A. 문헌자료, B. ㈜시선바이오머티리얼스 분석 결과 (Jiang, Peiyong, et al. "Lengthening and shortening of plasma DNA in hepatocellular carcinoma patients." Proceedings of the National Academy of Sciences 112.11 (2015): E1317-E1325.)
표 대표적인 표적유전자 선별 제품의 capture probe 디자인 형태 (Samorodnitsky, Eric, et al. "Comparison of custom capture for targeted next-generation DNA sequencing." The Journal of Molecular Diagnostics 17.1 (2015): 64-75.)
표 Guardant사 암 관련 유전자의 변이분석에 활용된 exon영역
표 PNA vs. DNA의 특성 비교
표 PNA 변형을 통한 결합력과 선택성의 조절 (염기서열의 붉은 부분이 변형된 PNA를 사용한 서열)
표 고민감도 돌연변이 검사법
표 Somatic mutation enrichment를 사용한 NGS 실험 결과
표 Somatic mutation enrichment를 사용한 저비율 변이의 증폭률 분석
표 고민감도 돌연변이 검출법을 사용한 KRAS 유전자 돌연변이 검사 결과와 일반 NGS 분석 결과의 비교 (The Korean Journal of Pathology 2014; 48: 100-107)
표 인공핵산(PNA)를 이용한 고민감도 차세대염기서열 분석 기술과련 연구 논문
표 cfDNA NGS Adater Assay (Ion S5)
표 cfDNA NGS Adater Assay (Miseq)
표 (수식) Sel-CapTM Lung Cancer Panel 제품
표 개발된 NGS 분석 알고리즘 모식도
표 NGS raw data 기반 임상활용 웹 어플리케이션 시스템
표 대한병리학회 부스 참석 사진
표 각 기관/기업별 역할
표 My Cancer Genome 에서 제공하는 변이정보
표 COSMIC 에서 제공하는 변이정보
표 암종별 유전변이 현황
표 폐암 표전유전자 변이 현황
표 폐암, 대장암, 유방암의 주요 유전자 변이가 삽입된 cell line list
표 (수식) ATCCTM & 한국세포주은행 database
표 NGS 기반 NCI-H1975 cell line 변이 분석
표 NGS 기반 PIK3CA 변이 cell line 분석
표 NGS 기반 PC-9 cell line 변이 분석
표 NGS 기반 Colo205 cell line 변이 분석 합 표준물질 실험구를 제작하였으며, NGS 분석을 통해 유전자 변이 비율을 검증
표 NGS 기반 KRAS 변이 cell line 분석
표 돌연변이 포함정도에 따른 민감도 테스트 범위
표 NGS 기반 변이 비율별 존재 여부 확인
표 다양한 Enhancing agent를 첨가한 혼성화 buffer의 효율 분석
표 Capture PNA probe의 결합 여부 확인 및 Capture PNA probe의 결합 온도 최적화 실험
표 특이적인 DNA capture를 위한 PNA probe의 최적 농도 분석
표 Capture PNA-DNA 결합 반응 시간 최적화 실험
표 A) ALK 유전자의 Fusion 돌연변이 분석 모식도
표 Oligo target DNA기반 capture 효율 분석
표 SW480 표준물질 기반 표적유전자 특이적 capture 효율 분석
표 SW480 표준물질 기반 KRAS 표적유전자 특이적 capture 효율 분석
표 NCI-H1975 표준물질 기반 표적유전자 특이적 capture 효울 분석
표 NCI-H1975 표준물질 기반 EGFR 표적유전자 특이적 capture 효율 분석
표 Capture PNA probe 제작 절차
표 표적유전자 capture 시스템 절차
표 Paired-end library 제작 방법
표 Specific adaptor primer 구성 및 서열 정보
표 Specific capture sequence
표 NGS 기반 특정 유전자 변이 검출용 capture system
표 Enrichment 효율 비교 분석
표 A549 (EGFR Exon 2), PC9(EGFR Exon 19), H1975 (EGFR Exon 20) Cell Line기반 Enrichment Probe Test 예시
표 농도별 최적화 조건실험
표 중합효소 연쇄반응 시약 최적화 조건실험
표 Digital Duplex Enrichment Sequence Library 제작 검증
표 키트별 ctDNA 추출 효율 비교
표 키트별 추출된 ctDNA 증폭 효율 비교 및 추출된 ctDNA 증폭 효율 비교 (ct 값 확인)
표 표준물질기반 변이 비율별 검출능
표 cfDNA 농도별 Digital Duplex Enrichment Sequence Library QC 결과
표 NGS 분석 결과 (1)
표 NGS 분석 결과 (Variant Call)
표 0.05%와 0% 변이 검출에 대한 재현성 분석 예시
표 0.05% 변이 검출에 대한 EGFR 돌연변이 검출의 재현성 분석 예시
표 표준물질기반 2개 NGS 플랫폼 일치도 분석
표 임상샘플기반 NGS 플랫폼별 EGFR 유전자 변이 비교 분석
표 제품 기술에 대한 특허 출원
표 Prototype 제품 구성
표 고민감도 NGS 분석 키트 활용 시스템 구축
표 최소검술한계 비교 분석 (L858R)
표 최소검술한계 비교 분석 (T790M)
표 최소검술한계 비교 분석 (19del)
표 M사 제품과 민감도 비교 분석
표 T사 제품과 민감도 비교 분석
표 특이도 비교 분석
표 전체일치율 비교 분석
표 1개의 γ-modification을 통한 PNA 프로브의 융해곡선 변화
표 2개의 γ-modification을 통한 PNA 프로브의 융해곡선 변화
표 특이도와 민감도를 향상시킬 수 있는 enrichment probe 디자인 *, 염기서열 및 modofication 위치는 비공개
표 HPLC 및 MALDI TOF 측정 예시 (#6)
표 나노입자에 Capture PNA probe을 고정시킬 수 있는 linker 후보군
표 L35 linker가 연결된 PNA oligomer
표 PNA oligomer에 L35 linker 도입과정 모식도
표 KRAS capture PNA probe 서열
표 Bead-Capture PNA 고정화 방법
표 Confocal microscopy를 이용한 Bead 고정화 효율 분석
표 Capture PNA probe 구조
표 Ver. 1과 2의 PNA 자동합성기의 모습
표 Fraction collector가 결합된 HPLC 동시병렬 정제 시스템의 모습
표 PNA oligomer 합성 및 정제 flow chart
표 자동합성기를 통한 대량 생산용 PNA oligomer 합성 및 정제 작업표준서(SOP)
표 Probe set design 프로세스
표 Probe set design 결과 예시
표 SNV 유형 Probe 디자인 방법
표 SV 유형 Probe 디자인 방법끝에서부터 Upstream과 Downstream 방향으로 지정한 step size 만큼 이동하면서
표 표적 유전자별 변이와 디자인한 프로브 수 현황
표 Probe 디자인 파이프라인 구동 결과 페암 진단 프로브 후보
표 디지털 시퀀싱 분석 파이프라인
표 변이 분석을 위한 전처리 과정 (바코드 추출 및 클러스터링)
표 BAM 파일 형식의 컬럼 설명
표 CIGER string의 의미
표 CIGAR string의 해성 방법 예시
표 참고한 바코드 클러스터링 방법 (Peng et al. BMC Genomics 2015)
표 바코드 정보를 갖고 있는 새 BAM 파일
표 파이썬 pysam 라이브러리 pileup을 이용한 변이 분석 알고리즘 일부 Ÿ GATK (Genome Analysis Toolkit)를 이용한 변이 분석 파이프라인은 질병 진단 분
표 Illumina 기반 뿐 아니라 Ione torrent 기반 데이터 지원을 위한 코드 보완 일부
표 변이 분석 결과 VCF 파일
표 타겟 변이 BED파일 형식 예시
표 smakemake로 체계화한 디지털 시퀀싱 NGS 분석 파이프라인 (3개 샘플 동시 구동시 모식도)
표 Q사에서 제공하는 온라인 변이 분석 도구
표 Q사의 분석결과와 비교 (“_컬럼명” 이 구축 파이프라인 결과)
표 MT depth 비교 (청색: Expected, 녹색: Observed)
표 UMT depth 비교 (청색: Expected, 녹색: Observed)
표 PI 비교 (청색: Expected, 녹색: Observed)
표 F사 결과를 정답으로 했을 때 민감도와 특이도
표 F사 결과와 본 분석 결과의 변이 빈도 상관분석
표 스케일 업/아웃 개념도
표 bcbio-nextgen 기반의 분석 파이프라인 구축
표 bcbio-nextgen 환경내 디지털 시퀀싱 파이프라인 디렉토리 구조
표 자원변동형 클라우드 환경에서의 스케일 아웃 구조 구성도
표 클라우드 서비스별 월 이용 요금 비교 (최저 수준의 스케일 아웃 가능 환경)
표 클라우드 서비스별 월 이용 요금 비교 차트
표 아마존 웹 서비스에 자원을 등록하고, 구동하는 화면 예시
표 Ansible 동작 환경 시스템 관리자가 Ansible을 실행하면 SSH를 통해 각 서버에 배포 스크립트를 실행 소스코드 저장소의 푸쉬 이벤트를 통해서도 Ansible 배포 스크립트를 실행할 수 있다
표 Ansible 배포 스크립트(클라우드용, 독립서버용)
표 Ansible 배포 스크립트(호스트 정보) 호스트 정보를 추가함으로써 스케일 아웃 시킬 수 있다
표 아마존 클라우드 서비스 (AWS) 기반 클러스터 환경 구축
표 성능 테스트에 사용한 분석 노드 스펙
표 멀티머신 성능 테스트 환경
표 멀티머신 (1, 2, 3 machines) 에서의 동일작업 수행 시간 비교
표 1, 2, 3 machines 환경에서의 CPU, 메모리, 프로세스 사용 현황
표 GridFTP 개념도 제3의 위치에서 노드간 파일전송 제어
표 엔드포인트 등록 후, “Globus Connect Personal” 프로그램 다운로드
표 globus.org에서의 파일전송 화면 엔드포인트가 등록되면, NGS 장비의 파일 현황을 확인하고, 제3의 위치에서 파일 전송을 제어할 수 있음
표 globus.org에서 회원 가입 후, 엔드포인트 등록 화면
표 분석용 웹 어플리케이션과 GridFTP 연결 구성도
표 GridFTP와 S3 파일전송 모듈의 차이점
표 globus.org를 이용해야 하는 GridFTP 아키텍처 및 디지털 시퀀싱 변이 분석을 수행하고, 결과 리포트를 열람할 수 있다.
표 HTTP 인터넷만 가능하면 이용 가능한 S3 아키텍처
표 웹 어플리케이션 ERD(데이터 모델)
표 임상활용이 가능한 리포트 생성 전체 과정 모식도
표 표적 변이에 대해 수집한 상세 변이 정보, 내성 약물 정보 현황 일부
표 탐지된 변이가 없는 경우의 리포트 예시
표 KRAS와 BRAF 유전자에서 각각 하나의 변이를 탐지했을 때 리포트 예시
표 https://liquidbio.labkm.net 으로 시스템 이용이 가능
표 사용자 로그인 화면
표 회원가입 화면 회원 가입 후, 관리자 승인을 받으면 시스템 사용 가능
표 로그인 후, 사용자 홈 대시화면
표 환자 정보 개별 등록 화면
표 환자 정보 일괄 등록 화면 주어진 엑셀 예제 형식에 맞추어 입력하면 일괄로 환자 정보가 입력됨
표 환자 정보 일괄 등록용 엑셀 파일 예시
표 등록 환자 목록 화면 각 환자의 상태 정보를 확인하고, 검색할 수 있음
표 파일전송 방법 선택 GridFTP 선택시 Globus 로그인이 필요함
표 GridFTP 설정 화면 Globus 로그인 후, 업로드 버튼을 클릭하여, 업로드할 파일 선택
표 GridFTP 파일 전송. Submit 버튼을 눌러 업로드 진행
표 업로드 진행 현황(Task) 확인 화면
표 Local (일반 HTTP 업로드) 선택 화면
표 Local 방식의 업로드 준비 화면
표 Local 방식의 파일전송 종료 화면
표 Local 방식의 파일전송 종료 화면
표 S3 방식의 파일 전송 선택 화면
표 S3 방식의 업로드 완료 화면
표 cyberduck 접속 프로파일 예시
표 cyberduck 파일 전송 화면
표 S3 방식의 업로드 완료 화면
표 QC 작업 실행 화면
표 QC 작업 수행 후, 시료 상세 화면
표 QC 결과 팝업 확인 화면 (FASTQC 결과)
표 QC 결과 팝업 확인 화면2 (FASTQC 결과)
표 QC 결과 팝업 확인 화면3 (FASTQC 결과)
표 디지털 시퀀싱 분석 실행 후 샘플 목록 화면
표 최종 분석 결과 VCF, Excel, PDF 출력
표 디지털 시퀀싱 분석 실행 후, 샘플 상세 화면
표 최종 분석 보고서 (B환자 - 2개 변이 발견)
표 최종 분석 보고서(C환자 - 변이 미발견)
표 Plasma샘플 보존기간 최적화에 대한 실험 디자인
표 (수식) Bioanalyzer 기반 1st 실험샘플 QC
표 (수식) NGS 기반 1st 실험샘플 표적유전자 변이 분석
표 혈액 수집 및 전처리 관련 보관 시스템 구축
표 DNA 농도 비교
표 실시간 PCR 기법으로 개선 된 DNA 추출 방법 검증
표 가톨릭대학교 산학협력단 (서울성모병원) IRB
표 건국대병원 IRB
표 서울성모병원 환자 샘플 수집 현황
표 건국대병원 환자 샘플 수집 현황
표 환자의 임상정보 (서울성모병원)
표 확보된 환자의 유전정보
표 임상샘플의 유전정보에 대한 DB구축을 위한 Clinical Data Sheet
표 수집된 샘플의 유전자 변이 분석에 이용된 분석법
표 FISH와 NGS 분석법을 이용한 ALK rearrangement 분석 비교. ALK probe를 이용하여 형광 신호에 따라 음성(A)과 양성(B)으로 판독되며, 동일한 환자 샘플에서 FISH와 NGS 분석법을 이용하여 비교함 (C)
표 유전자 변이 분석법에 따른 결과 비교
표 NGS 기반 암패널을 이용하여 폐선암 환자의 조직(A)과 혈액(B)에서 유전자 변이 분석
표 폐암환자의 조직과 혈장에서 EGFR 돌연변이 분석법에 따른 민감도와 특이도
표 pyrosequencer 혹은 PCR 기법과 NGS 키트의 민감도와 특이도
표 혈액에서 분석된 유전자 변이의 양적 비교 (예시, EGFR)
표 혈액에서 NGS 기반 암패널과 EGFR 유전자 변이 분석 비교
표 Sel-CapTMLungc ancer panel과 기존 NGS 키트의 민감도와 특이도
표 국외 액체생검분석서비스(Guardant360) 분석 결과
표 (수식) 국외 액체생검분석서비스(Guardant360)와 Sel-CapTM Lung Cancer Panel의 유전자 변이 분석 (예시, EGFR)
표 (수식) Sel-CapTM Lung Cancer Panel 분석법을 이용한 돌연변이 분석 (예시, EGFR T790M)
표 EGFR TKI 투여 받는 동안 주기적으로 수집된 혈액에서 T790M 분석
표 EGFR TKI 투여 받는 동안 주기적으로 수집된 혈액에서 EGFR 유전자 변이와 종양크기의 연관성

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