[보고서]LHFPL표적 진통원리 규명 및 이를 제어하는 신규 진통기술 개발

황선욱

보고서 정보

주관연구기관

고려대학교
Korea University

연구책임자

황선욱

참여연구자

PIAOHONGHUA , 김민석 , 유성재 , 임지연 , 조평선 , 채승연 , 최근열 , 최승인

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2018-12

과제시작연도

2017

주관부처

보건복지부
[Ministry of Health & Welfare(MW)(MW)

등록번호

TRKO202200008622

과제고유번호

1465024130

사업명

질환극복기술개발

DB 구축일자

2022-09-24

키워드

통각수용체.진통표적.개념정립.pain receptor.LHFPL.analgesic target.proof of concept.

표 6주령 normal mouse의 신경조직에서 LHFPL 계열 6종의 발현을 RT-PCR을 통해서 확인 하였음. (A) Nornal mouse의 각 신경조직 (Cerebellum, Hippocampus, Spinal cord, Trigeminal ganglion, Dorsal roots ganglion) 에서 LHFPL1을 제외하고 나머지 LHFPL 5종 (LHFP, LHFPL2, LHFPL3, LHFPL4, LHFPL5)이 발현되는 것을 확인하였음. 또한 Dorsal roots ganglion (DRG)에서의 발현 양상에 있어 특히 LHFPL2, LHFPL3, LHFPL4가 비교적 높은 발현도를 보였음
표 Immunohistochemistry로, mouse DRG 에서 발현하고 있는 LHFPL2와 pain development 와 관련 있는 Neuronal marker인 TRPV1, CGRP (Calcitonin gene-related peptide), NF200 (Neurofilament 200)과의 중첩된 것을 확인하였음. (A) DRG neuron에서 LHFPL2는 Green으로, TRPV1, CGRP, NF200은 Red로 나타냈으며 DRG nuclei는 파란색으로 나타내었음. 또한 화살표는 중첩된 DRG neuron을 가리킴. (B) DRG에서 발현하고 있는 LHFPL2와 pain development Marker들의 cell 수를 세어서 그래프화 하였음. LHFPL2를 positive로 보았을 때 중첩되는 Marker들의 cell %를 Green으로 표기 하였고, Marker를 positive로 보았을 때 중첩되는 LHFPL2의 cell %는 Red로 표기하였음. (LHFPL2/TRPV1 N수 : 211/84, LHFPL2/CGRP N수 : 234/182, LHFPL2/NF200 N수 : 190/96) (C) (B) 그래프에서 LHFPL2를 positive로 했을때의 값과 Marker를 positive로 했을 때의 값을 수치화 하였음
표 Immunohistochemistry로, mouse DRG 에서 발현하고 있는 LHFPL3와 pain development 와 관련 있는 Neuronal marker인 TRPV1, CGRP (Calcitonin gene-related peptide), NF200 (Neurofilament 200)과의 중첩된 것을 확인하였음. (A) DRG neuron에서 LHFPL3는 Green으로, TRPV1, CGRP, NF200은 Red로 나타냈으며 DRG nuclei는 파란색으로 나타내었음. 또한 화살표는 중첩된 DRG neuron을 가리킴. (B) DRG에서 발현하고 있는 LHFPL3와 pain development Marker들의 cell 수를 세어서 그래프화 하였음. LHFPL3를 positive로 보았을 때 중첩되는 Marker들의 cell %를 Green으로 표기 하였고, Marker를 positive로 보았을 때 중첩되는 LHFPL3의 cell %는 Red로 표기하였음. (LHFPL3/TRPV1 N수 : 355/324, LHFPL3/CGRP N수 : 384/182, LHFPL3/NF200 N수 : 155/83) (C) (B) 그래프에서 LHFPL3를 positive로 했을 때의 값과 Marker를 positive로 했을 때의 값을 수치화 하였음
표 Immunohistochemistry로, mouse DRG 에서 발현하고 있는 LHFPL4와 pain development 와 관련 있는 Neuronal marker인 TRPV1, CGRP (Calcitonin gene-related peptide), NF200 (Neurofilament 200)과의 중첩된 것을 확인하였음. (A) DRG neuron에서 LHFPL4는 Green으로, TRPV1, CGRP, NF200은 Red로 나타냈으며 DRG nuclei는 파란색으로 나타냄. 또한 화살표는 중첩된 DRG neuron을 가리킴. (B) DRG에서 발현하고 있는 LHFPL4와 pain development Marker들의 cell 수를 세어서 그래프화 하였음. LHFPL4를 positive로 보았을 때 중첩되는 Marker들의 cell %를 Green으로 표기하였고, Marker를 positive로 보았을 때 중첩되는 LHFPL4의 cell %는 Red로 표기하였음. (LHFPL4/TRPV1 N수 : 153/150, LHFPL4/CGRP N수 : 151/113, LHFPL4/NF200 N수 : 190/128) (C) (B) 그래프에서 LHFPL4를 positive로 했을 때의 값과 Marker를 positive로 했을 때의 값을 수치화 하였음
표 전체 DRG에서의 LHFPL2, LHFPL3, LHFPL4의 population을 측정하여 사이즈 별로 분포하는 양상을 확인함. Figure 2, 3, 4 를 바탕으로 그래프화 하였음. (A) DRG neuron에서 Total cell과 LHFPL2 가 발현하고 있는 cell 수를 측정하여 나타내었음. (B) LHFPL2가 발현하고 있는 DRG neuron 을 사이즈 별로 수를 측정해서 나타낸 % 그래프임. (C) DRG neuron에서 Total cell과 LHFPL3 가 발현하고 있는 cell 수를 측정하여 나타내었음. (D) LHFPL3가 발현하고 있는 DRG neuron 을 사이즈 별로 수를 측정해서 나타낸 % 그래프임. (E) DRG neuron에서 Total cell과 LHFPL4 가 발현하고 있는 cell 수를 측정하여 나타내었음. (F) LHFPL4가 발현하고 있는 DRG neuron 을 사이즈 별로 수를 측정해서 나타낸 % 그래프임
표 LHFPL2, LHFPL3, LHFPL4가 inflammatory pain에 영향을 미치는지 알아보기 위해서 Formalin test를 진행하였음. (A) 6주령 Normal mouse에 Scrambled RNA (3 μ g)와 LHFPL2 siRNA #2, LHFPL3 siRNA #1, LHFPL4 siRNA #1 (3 μg)을 Sciatic nerve에 주사한 뒤 48시간 후에 5% Formalin 20 μl를 발바닥에 주사한 직후부터 45분 동안 녹화하였고 5분 간격으로 licking, flinching의 소요시간을 측정하였음. (*p<0.05; Scrambled vs. LHFPL4, Two-way ANOVA) (B) 시간에 따라 Phase-1과 Phase-2로 나눠서 licking, flinching 소요시간의 합계를 평균값으로 나타냄. (**p<0.01; Scrambled vs. LHFPL3, Two-way ANOVA)
표 LHFPL2, LHFPL3, LHFPL4가 inflammatory pain에 영향을 미치는지 알아보기 위해서 Formalin test를 진행하였음. (A) 6주령 Normal mouse에 Scrambled RNA (3 μ g)와 LHFPL2 siRNA #2, LHFPL3 siRNA #1, LHFPL4 siRNA #1 (3 μg)을 Intrathecal에 주사한 뒤 48시간 후에 5% Formalin 20 μl를 발바닥에 주사한 직후부터 45분 동안 녹화하였고 5분 간격으로 licking, flinchin의 소요시간을 측정하였음. (*p<0.05; Scrambled vs. LHFPL2, #p<0.05; Scrambled vs. LHFPL3, $$p<0.01; Scrambled vs. LHFPL4, $$$p<0.001; Scrambled vs. LHFPL4, Two-way ANOVA) (B) 시간에 따라 Phase-1과 Phase-2로 나눠서 licking, flinching 소요시간의 합계를 평균값으로 나타냄. (*p<0.05; Scrambled vs. LHFPL4, Two-way ANOVA)
표 In vivo 상에서 LHFPL2가 다양한 자극에 대한 pain 기여 효과를 알아보기 위해서 Complete Freund`s Adjuvant (CFA) inflammation model을 대상으로 행동실험을 하였음. (A) von Frey test로, 5개의 그룹 (Sham, Scrambled, LHFPL2 siRNA #1, #2, #3)으로 나눠서 실험하였으며 Scrambled RNA (3 μg)와 LHFPL2 siRNA #1, #2, #3 (3 μg) 3가지를 Sciatic nerve에 주사하여 48시간 뒤에 Mechanical thresholds의 변화를 측정하였음. 그리고 CFA 10 μl를 발바닥에 주사하기 전에 Pre-test를 하였고 주사하고 24시간 후에 Post-test를 진행하였음. (B) Randall Selitto test로, 5개의 그룹 (Sham, Scrambled, LHFPL2 siRNA #1, #2, #3)으로 나눠서 실험하였으며 Scrambled RNA (3 μg)와 LHFPL2 siRNA #1, #2, #3 (3 μg) 3가지를 Sciatic nerve에 주사하여 48시간 뒤에 Mechanical thresholds의 변화를 측정하였음. 그리고 CFA 10 μl를 발바닥에 주사하기 전에 Pre-test 를 하였고 주사하고 24시간 후에 Post-test를 진행하였음. (C) Hot plate test로, 5개의 그룹 (Sham, Scrambled, LHFPL2 siRNA #1, #2, #3)으로 나눠서 실험하였으며 Scrambled RNA (3 μ g)와 LHFPL2 siRNA #1, #2, #3 (3 μg) 3가지를 Sciatic nerve에 주사하여 48시간 뒤에 Thermal thresholds의 변화를 측정하였음. 그리고 CFA 10 μl를 발바닥에 주사하기 전에 Pre-test를 하였고 주사하고 24시간 후에 Post-test를 진행하였음. (D) Edema test로, 5개의 그룹 (Sham, Scrambled, LHFPL2 siRNA #1, #2, #3)으로 나눠서 실험하였으며 Scrambled RNA (3 μg)와 LHFPL2 siRNA #1, #2, #3 (3 μg) 3가지를 Sciatic nerve에 주사하여 48시간 뒤에 발바닥 두께의 변화를 측정하였음. 그리고 CFA 10 μl를 발바닥에 주사하기 전에 Pre-test로 측정하였고 주사하고 24 시간 후에 Post-test로 측정하였음
표 In vivo 상에서 LHFPL3가 다양한 자극에 대한 pain 기여효과를 알아보기 위해서 Complete Freund`s Adjuvant (CFA) inflammation model을 대상으로 행동실험을 하였음. (A) von Frey test로, 5개의 그룹 (Sham, Scrambled, LHFPL3 siRNA #1, #2, #3)으로 나눠서 실험하였으며 Scrambled RNA (3 μg)와 LHFPL3 siRNA #1, #2, #3 (3 μg) 3가지를 Sciatic nerve 에 주사하여 48시간 뒤에 Mechanical thresholds의 변화를 측정하였음. 그리고 CFA 10 μl를 발바닥에 주사하기 전에 Pre-test 를 하였고 주사하고 24시간 후에 Post-test를 진행하였음. (*p<0.05; Scrambled vs. LHFPL3 #1, Two-way ANOVA) (B) Randall Selitto test로, 5개의 그룹 (Sham, Scrambled, LHFPL3 siRNA #1, #2, #3)으로 나눠서 실험하였으며 Scrambled RNA (3 μg)와 LHFPL3 siRNA #1, #2, #3 (3 μg) 3가지를 Sciatic nerve에 주사하여 48시간 뒤에 Mechanical thresholds의 변화를 측정하였음. 그리고 CFA 10 μl를 발바닥에 주사하기 전에 Pre-test를 하였고 주사하고 24시간 후에 Post-test를 진행하였음. (C) Hot plate test로, 5개의 그룹 (Sham, Scrambled, LHFPL3 siRNA #1, #2, #3)으로 나눠서 실험하였으며 Scrambled RNA (3 μg)와 LHFPL3 siRNA #1, #2, #3 (3 μg) 3가지를 Sciatic nerve 에 주사하여 48시간 뒤에 Thermal thresholds의 변화를 측정하였음. 그리고 CFA 10 μl를 발바닥에 주사하기 전에 Pre-test를 하였고 주사하고 24시간 후에 Post-test를 진행하였음. (D) Edema test로, 5개의 그룹 (Sham, Scrambled, LHFPL3 siRNA #1, #2, #3)으로 나눠서 실험하였으며 Scrambled RNA (3 μg)와 LHFPL3 siRNA #1, #2, #3 (3 μg) 3가지를 Sciatic nerve에 주사하여 48시간 뒤에 발바닥 두께의 변화를 측정하였음. 그리고 CFA 10 μl를 발바닥에 주사하기 전에 Pre-test로 측정하였고 주사하고 24시간 후에 Post-test로 측정하였음
표 In vivo 상에서 LHFPL4가 다양한 자극에 대한 pain 기여효과를 알아보기 위해서 Complete Freund`s Adjuvant (CFA) inflammation model을 대상으로 행동실험을 하였음. (A) von Frey test로, 5개의 그룹 (Sham, Scrambled, LHFPL4 siRNA #1, #2, #3)으로 나눠서 실험하였으며 Scrambled RNA (3 μg)와 LHFPL4 siRNA #1, #2, #3 (3 μg) 3가지를 Sciatic nerve에 주사하여 48시간 뒤에 Mechanical thresholds의 변화를 측정하였음. 그리고 CFA 10 μl를 발바닥에 주사하기 전에 Pre-test를 하였고 주사하고 24시간 후에 Post-test를 진행하였음. (B) Randall Selitto test로, 5개의 그룹 (Sham, Scrambled, LHFPL4 siRNA #1, #2, #3)으로 나눠서 실험하였으며 Scrambled RNA (3 μg)와 LHFPL4 siRNA #1, #2, #3 (3 μg) 3가지를 Sciatic nerve에 주사하여 48시간 뒤에 Mechanical thresholds의 변화를 측정하였음. 그리고 CFA 10 μl를 발바닥에 주사하기 전에 Pre-test 를 하였고 주사하고 24시간 후에 Post-test를 진행하였음. (C) Hot plate test로, 5개의 그룹 (Sham, Scrambled, LHFPL4 siRNA #1, #2, #3)으로 나눠서 실험하였으며 Scrambled RNA (3 μ g)와 LHFPL4 siRNA #1, #2, #3 (3 μg) 3가지를 Sciatic nerve에 주사하여 48시간 뒤에 Thermal thresholds의 변화를 측정하였음. 그리고 CFA 10 μl를 발바닥에 주사하기 전에 Pre-test를 하였고 주사하고 24시간 후에 Post-test를 진행하였음. (D) Edema test로, 5개의 그룹 (Sham, Scrambled, LHFPL4 siRNA #1, #2, #3)으로 나눠서 실험하였으며 Scrambled RNA (3 μg)와 LHFPL4 siRNA #1, #2, #3 (3 μg) 3가지를 Sciatic nerve에 주사하여 48시간 뒤에 발바닥 두께의 변화를 측정하였음. 그리고 CFA 10 μl를 발바닥에 주사하기 전에 Pre-test로 측정하였고 주사하고 24시간 후에 Post-test로 측정하였음
표 LHFPL3가 말초신경에 분포하고 있는 통증 수용체인 ion channel (TRPV1, TRPA1, TRPV4)과 GABAA receptor 그리고 다른 ion channel에 영향을 미치는지를 알아보기 위하여 Scrambled RNA와 LHFPL3 siRNA Knockdown model (LHFPL3 Kd)을 만든 뒤에 Capsaicin, AITC, Prostaglandin, Muscimol, KCl을 사용하여 inflammation pain을 유도하고 licking, flinching의 소요시간을 측정하였음. (A) TRPV1의 agonist인 Capsaicin에 대한 licking, flinching의 행동 반응을 5분간 측정하였음. (B) TRPV4의 agonist인 Prostaglandin과 함께 hypotonic한 자극을 주기 위해 사용한 deionized water (DW)에 대한 licking, flinching의 행동 반응을 10분간 측정하였음. (C) TRPA1 의 agonist인 AITC에 대한 licking, flinching의 행동 반응을 5분간 측정하였음. (**p<0.01; Scrambled vs. LHFPL3, T-test, ***p<0.001; Scrambled vs. LHFPL3, Two-way ANOVA) (D) GABAA receptor의 agonist 인 Muscimol과 Muscimol의 반응을 더 활성화시키기 위해 사용한 Prostaglandin에 대한 licking, flinching의 행동 반응을 30분간 측정하였음. (E) TRP channel이 아닌 Na+ channel, K+ channel, Ca2+ channel의 agonist인 KCl을 사용하여 licking, flinching의 행동 반응을 10분간 측정하였음
표 In vitro 상에서 LHFPL3가 Chemical한 자극에 대해 반응하는 통증 수용체인 TRPV1 활성에 영향을 미치는지를 알아보기 위해서 HEK 293T cell을 사용하여 Calcium imaging을 통해 확인하였음. (A) HEK 293T cell에 TRPV1을 transfection 시킨 것과 LHFPL3와 TRPV1을 co-transfection 시킨 것 그리고 LHFPL5와 TRPV1을 co-transfection 시켜서 Capsaicin 0.3 μM을 관류시켰을때 반응하는 cell의 수를 %로 나타낸 그래프임. (TRPV1 : 56.9%, LHFPL3+TRPV1 : 79.3%, LHFPL5+TRPV1 : 58.75%, *p<0.05; TRPV1 vs. LHFPL3+TRPV1, t-test) (B) Fluorescence ratio (340/380 nm wavelength)의 따라 나타나는 세포 내 Ca2+ 변화를 peak 값 1.2 이상의 대한 trace들을 선택해서 평균값으로 나타낸 그래프임. (TRPV1 : 1.56, LHFPL3+TRPV1 : 1.96, LHFPL5+TRPV1 : 1.74, **p<0.01; TRPV1 vs. LHFPL3+TRPV1, t-test) (C) TRPV1 을 transfection 시킨 cell에서 Capsaicin 0.3 μM에 반응하는 cell의 trace를 따온 그래프임. (D) LHFPL3와 TRPV1을 co-transfection 시킨 cell에서 Capsaicin 0.3 μM에 반응하는 cell의 trace를 따온 그래프임. (E) (C)와 같이 Capsaicin 0.3 μ M에 반응하는 cell의 trace를 따온 그래프임. (F) LHFPL5와 TRPV1 을 co-transfection 시킨 cell에 서 Capsaicin 0.3 μM에 반응하는 cell의 trace를 따온 그래프임. (C, D, E, F Black bar : Capsaicin 0.3 μM 처리할 때, Gray bar : washing 할 때)
표 In vitro 상에서 LHFPL3 가 Chemical한 자극에 대해 반응하는 통증 수용체인 TRPV4 활성에 영향을 미치는지를 알아보기 위해서 HEK 293T cell을 사용하여 Calcium imaging을 통해 확인하였음. (A) HEK 293T cell에 TRPV4을 transfection 시킨 것과 LHFPL3와 TRPV4를 co-transfection 시킨 것 그리고 LHFPL5와 TRPV4를 co-transfection 시켜서 GSK1016790a 30 nM를 관류시켰을 때 반응하는 cell의 수를 %로 나타낸 그래프임. (TRPV4 : 81.3%, LHFPL3+TRPV4 : 90.4%, LHFPL5+TRPV4 : 84.8%) (B) Fluorescence ratio (340/380 nm wavelength)의 따라 나타나는 세포 내 Ca2+ 변화를 peak 값 1.2 이상의 대한 trace들을 선택해서 평균값으로 나타낸 그래프임. (TRPV4 : 1.59, LHFPL3+TRPV4 : 1.75, LHFPL5+TRPV4 : 1.65) (C) TRPV4을 transfection 시킨 cell에서 GSK1016790a 30 nM에 반응하는 cell 의 trace를 따온 그래프임. (D) LHFPL3와 TRPV4을 co-transfection 시킨 cell에서 GSK1016790a 30 nM에 반응하는 cell의 trace를 따온 그래프임. (E) (C)와 같이 GSK1016790a 30 nM에 반응하는 cell의 trace를 따온 그래프임. (F) LHFPL5와 TRPV4을 co-transfection 시킨 cell에서 GSK1016790a 30 nM에 반응하는 cell 의 trace를 따온 그래프임. (C, D, E, F Black bar : GSK1016790a 30 nM 처리 할 때, Gray bar : washing 할때)
표 In vitro 상에서 LHFPL3 가 Chemical한 자극에 대해 반응하는 통증 수용체인 TRPA1 활성에 영향을 미치는지를 알아보기 위해서 HEK 293T cell을 사용하여 Calcium imaging을 통해 확인하였음. (A) HEK 293T cell에 TRPA1을 transfection 시킨 것과 LHFPL3와 TRPA1을 co-transfection 시킨 것 그리고 LHFPL5와 TRPA1을 co-transfection 시켜서 Cinnamaldehyde 300 μM를 관류시켰을 때 반응하는 cell의 수를 % 로 나타낸 그래프임. (TRPA1 : 98%, LHFPL3+TRPA1 : 80.6%, LHFPL5+TRPA1 : 70.8%, *p<0.05; TRPA1 vs. LHFPL5+TRPA1, t-test) (B) Fluorescence ratio (340/380 nm wavelength)의 따라 나타나는 세포내 Ca2+ 변화를 peak 값 1.2 이상의 대한 trace들을 선택해서 평균값으로 나타낸 그래프임. (TRPA1 : 2.66, LHFPL3+TRPA1 : 1.59, LHFPL5+TRPA1 : 1.46, *p<0.05; TRPA1 vs. LHFPL5+TRPA1, *p<0.05; TRPA1 vs. LHFPL3+TRPA1, **p<0.01; TRPA1 vs. LHFPL5+TRPA1, t-test) (C) TRPA1을 transfection 시킨 cell에서 Cinnamaldehyde 300 μM에 반응하는 cell의 trace를 따온 그래프임. (D) LHFPL3와 TRPA1을 co-transfection 시킨 cell에서 Cinnamaldehyde 300 μM에 반응하는 cell의 trace를 따온 그래프임. (E) (C)와 같이 Cinnamaldehyde 300 μM에 반응하는 cell의 trace를 따온 그래프임. (F) LHFPL5와 TRPA1을 co-transfection 시킨 cell에서 Cinnamaldehyde 300 μM에 반응하는 cell의 trace를 따온 그래프임. (C, D, E, F Black bar : Cinnamaldehyde 300 μM 처리할 때, Gray bar : washing 할 때)
표 In vitro 상에서 LHFPL3가 Mechanical한 자극에 대해 반응하는 통증 수용체인 TRPV4 활성에 영향을 미치는지를 알아보기 위해서 HEK 293T cell을 사용하여 Calcium imaging을 통해 확인하였음. (A) HEK 293T cell 에 TRPV4을 transfection 시킨 것과 LHFPL3와 TRPV4를 co-transfection 시킨 것 그리고 LHFPL5와 TRPV4를 co-transfection 시켜서 Hypotonic solution (200 mOsm/kg)를 관류시켰을 때 반응하는 cell의 수를 %로 나타낸 그래프임. (TRPV4 : 49.8%, LHFPL3+TRPV4 : 66.3%, LHFPL5+TRPV4 : 71%) (B) Fluorescence ratio (340/380 nm wavelength)의 따라 나타나는 세포 내 Ca2+ 변화를 peak 값 1.2 이상의 대한 trace들을 선택해서 평균 값으로 나타낸 그래프임. (TRPV4 : 1.41, LHFPL3+TRPV4 : 1.37, LHFPL5+TRPV4 : 1.5) (C) TRPV4을 transfection 시킨 cell에서 Hypotonic solution (200 mOsm/kg)에 반응하는 cell의 trace를 따온 그래프임. (D) LHFPL3와 TRPV4을 co-transfection 시킨 cell에서 Hypotonic solution (200 mOsm/kg)에 반응하는 cell의 trace를 따온 그래프임. (E) (C)와 같이 Hypotonic solution (200 mOsm/kg)에 반응하는 cell의 trace를 따온 그래프임. (F) LHFPL5와 TRPV4을 co-transfection 시킨 cell에서 Hypotonic solution (200 mOsm/kg)에 반응하는 cell의 trace를 따온 그래프임. (C, D, E, F Black bar : Hypotonic solution (200 mOsm/kg) 처리할 때, Gray bar : washing 할 때)
표 In vitro 상에서 LHFPL3가 Mechanical한 자극에 대해 반응하는 통증 수용체인 TRPA1 활성에 영향을 미치는지를 알아보기 위해서 HEK 293T cell을 사용하여 Calcium imaging을 통해 확인하였음. (A) HEK 293T cell에 TRPA1을 transfection 시킨 것과 LHFPL3와 TRPA1을 co-transfection 시킨 것 그리고 LHFPL5와 TRPA1을 co-transfection 시켜서 Hypertonic solution (1200 mOsmkg)를 관류시켰을 때 반응하는 cell의 수를 %로 나타낸 그래프임. (TRPA1 : 51.5%, LHFPL3+TRPA1 : 83.7%, LHFPL5+TRPA1 : 52%, **p<0.01; TRPA1 vs. LHFPL3+TRPA1, t-test) (B) Fluorescence ratio (340/380 nm wavelength)의 따라 나타나는 세포 내 Ca2+ 변화를 peak 값 1.2 이상의 대한 trace들을 선택해서 평균값으로 나타낸 그래프임. (TRPA1 : 1.6, LHFPL3+TRPA1 : 1.42, LHFPL5+TRPA1 : 1.38, **p<0.01; TRPA1 vs. LHFPL5+TRPA1, t-test) (C) TRPA1 을 transfection 시킨 cell에서 Hypertonic solution (1200 mOsmkg)에 반응하는 cell의 trace 를 따온 그래프임. (D) LHFPL3와 TRPA1을 co-transfection 시킨 cell에서 Hypertonic solution (1200 mOsmkg)에 반응하는 cell의 trace 를 따온 그래프임. (E) (C)와 같이 Hypertonic solution (1200 mOsmkg)에 반응하는 cell의 trace 를 따온 그래프임. (F) LHFPL5와 TRPA1을 co-transfection 시킨 cell에서 Hypertonic solution (1200 mOsmkg)에 반응하는 cell의 trace를 따온 그래프임. (C, D, E, F Black bar : Hypertonic solution (1200 mOsmkg) 처리할 때, Gray bar : washing 할 때)
표 HEK 293T cell에 TMC3를 transfection 시킨 것과 LHFPL3와 TMC3를 co-transfection 시켜서 Mechanical probe displacement에 의한 current 발생을 whole cell voltage-clamp electrophysiology로 확인하였음. (A) TMC3를 transfection 시킨 HEK 293T cell에서 0.4 ㎛ 간격으로 Cell membrane을 자극할 때 probe displacement에 의해 Inward current가 발생하였음. Membrane potential은 –60 mV임. (2.4 ㎛ : -152.7 pA, 2.8 ㎛ : -196.6 pA, 3.2 ㎛ : -351.3 pA, 3.6 ㎛ : -511.3 pA) (B) LHFPL3와 TMC3 를 co-transfection 시킨 HEK 293T cell에서 0.4 ㎛ 간격으로 Cell membrane을 자극할 때 probe displacement에 의해 Inward current 가 발생하였음. Membrane potential 은 –60 mV임. (4.8 ㎛ : -154.9 pA, 5.6 ㎛ : -185.3 pA)
표 LHFPL3가 GABAA receptor 활성에 영향을 미치는지를 알아보기 위해서 GABAA receptor의 agonist인 Muscimol을 DRG에 주사하여 행동실험을 진행하였음. (A) Baseline은 Normal mouse로 von Frey test를 진행하였고, Pre-test와 Post-test는 scrambled RNA (3 μ g)와 LHFPL3 siRNA (3 μg)를 sciatic nerve에 주사하여 48시간 뒤에 Mechanical thresholds의 변화를 측정하였음. 그리고 CFA 10 μl를 발바닥에 주사하고 24시간 뒤에 Pre-test를 진행하였고, CFA model에서 Muscimol 1 mM 3 μl를 DRG에 주사하고 Post-test를 실행하였음. (*p<0.05; Scrambled vs. LHFPL3, t-test) (B) Baseline은 Normal mouse로 Randall Selitto test 를 진행하였고, Pre-test와 Post-test는 scrambled RNA (3 μg)와 LHFPL3 siRNA (3 μg)를 sciatic nerve에 주사하여 48시간 뒤에 Mechanical thresholds의 변화를 측정하였음. 그리고 CFA 10 μl를 발바닥에 주사하고 24시간 뒤에 Pre-test를 진행하였고, CFA model에서 Muscimol 1 mM 3 μl를 DRG에 주사하고 Post-test를 실행하였음. (C) Baseline은 Normal mouse로 Hot plate test를 진행하였고, Pre-test와 Post-test는 scrambled RNA (3 μ g)와 LHFPL3 siRNA (3 μg)를 sciatic nerve에 주사하여 48시간 뒤에 Thermal thresholds의 변화를 측정하였음. 그리고 CFA 10 μl를 발바닥에 주사하고 24시간 뒤에 Pre-test를 진행하였고, CFA model에서 Muscimol 1 mM 3 μl를 DRG에 주사하고 Post-test를 실행하였음. (Kd : Knockdown)

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LHFPL표적 진통원리 규명 및 이를 제어하는 신규 진통기술 개발
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