초록 ▼

□ 연구의 목적 및 내용
유방암 환자의 치료 성적 향상을 위하여 종양 억제 효능이 뛰어나고 생체 내 지속성이 좋은 유전자 변형 T 세포를 개발하고자 함. 변형하고자 하는 유전자는 T세포 수용체 유전자와 T 세포의 분화와 관련된 유전자임.

□ 연구개발성과
- 6명 유방암 환자에서 dominant한 clone을 규명하였고, Top 10 clone들의 TCR α와 β 시퀀스를 밝혀내었음.
- 2명의 정상인 혈액에서 분리된 CD3 positive T 세포로부터 naive like T cells (Tn-like)

□ 연구의 목적 및 내용
유방암 환자의 치료 성적 향상을 위하여 종양 억제 효능이 뛰어나고 생체 내 지속성이 좋은 유전자 변형 T 세포를 개발하고자 함. 변형하고자 하는 유전자는 T세포 수용체 유전자와 T 세포의 분화와 관련된 유전자임.

□ 연구개발성과
- 6명 유방암 환자에서 dominant한 clone을 규명하였고, Top 10 clone들의 TCR α와 β 시퀀스를 밝혀내었음.
- 2명의 정상인 혈액에서 분리된 CD3 positive T 세포로부터 naive like T cells (Tn-like), central memory T cells (Tcm), effector memory T cells (Tem)에 대한 RNA-seq을 진행하여 분화연관 인자 리스트를 확보하였으며, 이 중 하나의 유전자에 대한 기능 연구를 수행하였음.
- 7명의 유방암 환자에서 PBMC, 종양세포, 종양침윤림프구, PDX를 확보하였고, 1명의 유방암 환자에서 PBMC, 종양침윤림프구, PDX를 확보하였음.
- 빠르고 편리한 TCR pair 공여 플라스미드 제작법을 구축하고 이를 성공적으로 T 세포내에 도입하였음.
- 8명의 유방암 환자로부터 말초혈액단핵세포 및 종양침윤림프구 분리하였으며, TCR 시퀀싱을 진행하여, dominant TCR pair를 규명하였음.
- CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 T cell에서의 유전자 녹아웃을 최적화하였음. 또한 표적 위치에 TCR pair을 삽입하는 방법을 구축하였음. 삽입된 TCR pair 발현 확인 단계에서 어려움이 있어 다소 지체되었으나 다양한 TCR pair 삽입방법을 도입하여 효과적으로 TCR 발현 세포를 분리하였음.
- MART-1 특이적으로 반응하는 TCR을 Jurkat cell에 삽입하고, 삽입 효율을 FACS분석을 통하여 수행하였음. 또한, TCR이 삽입된 Jurkat cell의 효능을 MART-1펩타이드를 표지하는 T2 cell과의 co-culture를 확인하였음.
- TCR pair를 세포 내에 삽입하기 위한 lentiviral construct를 효율적으로 제작하는 방법을 구축하였음. 이를 통해 유방암 환자로부터 규명된 dominant TCR에 대한 100가지 pair를 구축하였음(국내 특허 출원).
- 상기 구축된 TCR pair library를 이용하여 환자 세포에 특이적으로 반응하는 TCR pair를 찾는 스크리닝을 수행하였으나 유의미한 TCR pair를 찾는데 실패하였음.

□ 연구개발성과의 활용계획 (기대효과)
- 유전자 변형 T 세포 제작 기술은 최근에 시도되는 것으로서 본 연구를 통해 효율적인 T 세포 유전자 조작 기술을 확립하게 된다면 기존에 없던 새로운 기술이 개발되는 것임. 이를 기반으로 사업화가 가능하며 국제시장의 선점 가능성이 있음.
- T 세포의 분화 단계를 조절할 수 있는 인자의 발굴 및 이를 조절한 T 세포의 효력이 검증될 경우 세포치료 제 개발의 비약적인 발전이 가능함.
- T 세포 수용체 sequencing 기술은 최근 개발되고 있으며, 국내에는 분석 서비스를 제공하는 기관이 없고 외국에도 아직까지 제대로 된 기술을 보유한 기관이 없음. 따라서 T 세포 수용체 sequencing 기술을 사용하고 검증하는 본 연구를 통해 관련 기술의 최적화가 가능함.
- 환자 맞춤 세포치료제나 백신을 이용한 치료법의 개발로 관련 산업의 성장이 촉발됨.

(출처 : 요약문 12p)

Abstract ▼

□ Purpose&Contents
We developed engineered T cells with enhanced antitumor activity and durability.

□ Results
- Identification of dominant TCR clones and their sequences from 6 breast cancer patients
- RNA sequencing and differentially expressed gene analysis using naive like T cells

□ Purpose&Contents
We developed engineered T cells with enhanced antitumor activity and durability.

□ Results
- Identification of dominant TCR clones and their sequences from 6 breast cancer patients
- RNA sequencing and differentially expressed gene analysis using naive like T cells (Tn-like), central memory T cells (Tcm), effector memory T cells (Tem) from CD3+ T cells of 2 healthy donor PBMC
- Establishment of PBMC, cancer cell culture, TIL culture, PDX from 8 breast cancer patients
- Optimization of gene knock out using CRISPR-Cas9 system
- Establishment of TCR pair insertion method
- Insertion of MART-1 specific TCR to Jurkat cell and identification of their efficacy

□ Expected Contribution
- Gene engineered T cell establishment is a newly developed technique. Based on the results, we can dominate global market.
- We can stimulate development of cell therapy using identified T cell differentiation regulating agents.
- We could optimize TCR sequencing and analysis technology.
- We can expect expansion of personalized cell therapy and vaccine strategy.

(source : SUMMARY 13p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 보고서요약 ... 2
• 제 출 문 ... 10
• 보고서 요약서 ... 11
• 국문 요약문 ... 12
• SUMMARY ... 13
• 목차 ... 14
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 16
• 1-1. 연구개발 목적 ... 16
• 1-2. 연구개발의 필요성 ... 16
• 1-3. 연구개발 범위 ... 17
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 18
• 2-1. 유방암에서 면역관련 인자들의 치료반응성 예측과 예후와의 관련성 ... 18
• 2-2. 종양의 면역 및 세포치료(immunotherapy, cell therapy) ... 19
• 2-3. Neoantigen ... 20
• 2-4. TCR repertoire 및 clonotype ... 22
• 2-5. TCR sequencing ... 23
• 2-6. T cell engineering ... 25
• 2-7. 유전자 가위 기술의 발전과 기능 ... 27
• 2-8. CRISPR/Cas9 시스템 ... 28
• 2-9. T cell engineering에서 T 림프구 population의 중요성 ... 28
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 30
• 3-1. 유방암 환자에서 TCR 시퀀싱을 통한 dominant TCR pair 규명 ... 30
• 3-2. 유방암 환자에서 TCR 시퀀싱을 통한 dominant TCR pair 규명 ... 31
• 3-3. 분화단계별 T 세포 subset 특성 조사를 통한 분화연관 인자 규명 ... 45
• 3-4. 유방암 환자의 시료 추가 수집 ... 48
• 3-5. T 세포 내 유전자 도입 방법 구축 ... 50
• 3-6. 말초혈액 및 종양 조직으로부터 T 세포 분리 ... 53
• 3-7. RNA isolation 및 TCR 시퀀싱 ... 53
• 3-8. dominant TCR pair 규명 ... 56
• 3-9. 유방암 환자 TCR 유전자 변형 T 세포 효능 평가 ... 58
• 3-10. 분화연관 인자 조절 유전자 변형 T 세포 효능 평가 ... 60
• 3-11. MTX selection marker를 이용한 TCR pair 삽입 플랫폼 구축 ... 61
• 3-12. Selection free TCR pair 삽입 플랫폼 구축 ... 63
• 3-13. TRAC 유전자 타겟 TCR pair 삽입 플랫폼 제작 ... 63
• 3-14. T 세포에 도입할 유방암 환자 TCR pair 규명 ... 65
• 3-15. 분화과정에서의 T 세포 subset 특성 조사 및 T 세포 분화연관 인자 규명 ... 65
• 3-16. T 세포 내 유전자 도입 방법 구축 ... 66
• 3-17. 유방암 환자 TCR 유전자 변형 T 세포 제작 및 효능 평가 ... 68
• 3-18. 항원 NY-ESO-1 TCR 유전자 변형 T 세포의 효능 평가 ... 69
• 3-19. Memory T 세포 비율 증가를 위한 분화연관 인자 유전자 변형 T 세포 생산 및 효능 평가 ... 69
• 3-20. TCR과 분화연관 인자가 동시에 조절된 유전자 변형 T 세포 생산 ... 71
• 3-21. 유전자 변형 T 세포 시작품 생산 ... 71
• 4. 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 73
• 4-1. 목표달성도 ... 73
• 4-2. 관련분야 기여도 ... 74
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 74
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 75
• 7. 연구개발성과의 보안등급 ... 76
• 8. 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비 현황 ... 76
• 9. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 76
• 10. 연구개발과제의 대표적 연구실적 ... 77
• 11. 기타사항 ... 78
• 12. 참고문헌 ... 79
• 끝페이지 ... 81