초록 ▼

연구의 목적 및 내용
루푸스는 체액면역반응에 의한 전신적 만성 자가면역질환으로, 대표적인 난치성 질환임. 본 과제에서 루푸스의 주요 병인 세포인 Tfh세포와 장수형질세포(long-lived plasma cells)를 선택적으로 표적하는 기능이 강화된 중간엽줄기세포치료제[superimmunoregulatory (si)-MSC]를 개발하여, 불응성 루푸스를 효과적으로 조절할 수 있는 원천기술을 제시함. 구체적인 세부목표는 다음과 같음.
● 정상마우스 유래 naive MSC (nMSC)에 CXCR5, soluble IL-21R

연구의 목적 및 내용
루푸스는 체액면역반응에 의한 전신적 만성 자가면역질환으로, 대표적인 난치성 질환임. 본 과제에서 루푸스의 주요 병인 세포인 Tfh세포와 장수형질세포(long-lived plasma cells)를 선택적으로 표적하는 기능이 강화된 중간엽줄기세포치료제[superimmunoregulatory (si)-MSC]를 개발하여, 불응성 루푸스를 효과적으로 조절할 수 있는 원천기술을 제시함. 구체적인 세부목표는 다음과 같음.
● 정상마우스 유래 naive MSC (nMSC)에 CXCR5, soluble IL-21R-Fc, soluble Baff R-Fc 재조합 유전자 도입으로 follicle homing 능력, Tfh 세포 활성 차단 능력, PC 생존 차단 능력이 강화된 MSC 라인을 제작하고 in vitro에서 검증
● 루푸스 질환모델인 NZB/W F1과 sanroque 마우스 생체 내에서, si-MSC의 치료제로서의 효능이 nMSC보다 우수한지를 비교 분석
● 질환모델 내 si-MSC 세포주의 분포, 약리기전, 안전성 등을 분석

연구개발성과
1. 정상 마우스로 부터 MSC 세포주 표현형을 충족시키는 세포주를 확보 하였고, 고유 성능인 다른 조직세포로의 분화를 검증함.
2. 기능을 강화시키기 위한 유전자를 클로닝을 통하여 모두 확보하였고, 해당 유전자들의 능력을 확인함.
3. CXCR5 벡터를 MSC 세포주에 이입하였고, transwell을 통해 CXCL13 농도구배로 유전자 이입 MSC 세포주의 이동이 일어나는 것을 정량적으로 산출함.
4. sIL-21R-Fc 벡터를 MSC 세포주에 이입하였고, Tfh 분화조건에 놓인 naive T 세포의 분화를 활발하게 억제하는 것을 확인함.
5. MRL/lpr 마우스는 자연발생 돌연변이로 교배를 통해 추가적인 검증 없이 마우스를 확보하는데 용이함.
6. 불응성 루푸스의 대표적인 마커로 알려진 anti-dsDNA와 단백뇨 분석을 각각 혈청과 unrine에서 측정하여 정량하는 방법을 ELISA를 통해 확립함.
7. C57BL/6 마우스에 면역화를 통해 면역반응을 일으키고 si-MSC에 의한 항체 생성과 항체분비세포의 감소를 관찰함.
8. nMSC와 si-MSC 세포주를 주입하여 MRL/lpr 마우스의 생존율 및 자가항체 생성과 단백뇨를 측정하여 유효성을 검증함.
9. KRN-T cell-induced arthritis 모델에서 MSC 세포주 주입에 의한 관절염 발생 감소 및 질환 발생 억제 메카니즘을 분석함.
10. Bach2 결핍 마우스에서 루푸스 유사 증상이 자발적으로 발생함을 관찰하여 새로운 루푸스 모델마우스로 제시하고 그 메카니즘을 최초로 밝힘.

연구개발성과의 활용계획(기대효과)
● 혁신적인 루푸스 줄기세포신약을 개발할 수 있는 원천기술을 창출하여 불치의 병 극복의 실현
● 병인 세포를 표적하는 특이성과 기능이 강화된 MSC 치료제를 루푸스 이외의 다른 체액면역질환에 확대 적용 가능함
● 줄기세포 배양기술과 최첨단 conditioning 기술이 융합된 신산업 창출
● 환자 유래 MSC의 기능 장애를 극복하여 루푸스 질환의 MSC 세포치료를 실현함

(출처 : 요약문 12p)

Abstract ▼

Purpose&Contents
Systemic lupus erythematosus (SLE, or lupus) is a incurable autoimmune disease with multiorgan inflammation. In this study, we develop a super-immunoregular therapy (si)-MSC with enhanced function to selectively target Tfh cells and long-lived cells, the main cause cells of lupus

Purpose&Contents
Systemic lupus erythematosus (SLE, or lupus) is a incurable autoimmune disease with multiorgan inflammation. In this study, we develop a super-immunoregular therapy (si)-MSC with enhanced function to selectively target Tfh cells and long-lived cells, the main cause cells of lupus. Specific goals include:
● Produce a Tfh-MSC line, which is transducted with CXCR5 and IL21R-Fc producing vector in naive MSC, and their roles are verified in vitro.
● Generate a pc-MSC line, which is transducted with CXCR5 and Baff R-Fc expressing vector in naive MSC, and their roles are verified in vitro.
● Analyze the efficacy of TfhMSC or pc-MSC treatment for lupus in NZB/W and Sanroque mice.
● The distribution, pharmacology and safety of Tfh-MSC and pc-MSC are analyzed in the disease model.

Results
1. We obtained MSC cell lines that fulfill the criteria of MSC cells from WT mice and verified that these cells can differentiate into other tissue cells.
2. We generated CXCR5-expressing MSC and these cells preferentially migrated toward increasing CXCL13 gradients.
3. We produced sIL-21R-Fc-expressing MSC cell lines and these cells inhibited the differentiation of CD4 T cells into Tfh cells under Tfh differentiation condition.
4. We established the methods of quantifying anti-dsDNA and proteinuria using ELISA in serum and urine respectively.
5. Si-MSC transfer reduced the levels of antibodies and the number of antibody-secretion cells in B6 mice immunized with NP-KLH/CFA.
6. We examined the in vivo efficacy of MSC and si-MSC in lupus-prone MRL/lpr mouse.
7. We demonstrated that MSC treatment may alleviate the development of KRN-T cell-induced arthritis.
8. We suggested old Bach2-deficient mice as a new lupus mouse model.

Expected Contribution
● overcoming an incurable disease by creating of original technology to develop innovative lupus stem cell drugs
● Therapeutic applications can be extended to other humoral autoimmune disease
● Realization of MSC cell therapy in lupus disease by overcoming functional disability of patient origin MSC
● Creating a new industry that combines stem cell culture and cutting-edge conditioning technology

(source : SUMMARY 13p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 보고서요약 ... 2
• 제출문 ... 10
• 보고서 요약서 ... 11
• 국문 요약문 ... 12
• SUMMARY ... 13
• 목차 ... 14
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 16
• 1-1. 연구개발 목적 ... 16
• 1-2. 연구개발의 필요성 ... 17
• 1-3. 연구개발 범위 ... 18
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 23
• 2-1. 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus; 이하 루푸스) 임상 특징 ... 23
• 2-2. 현 루푸스 치료의 현황 및 문제점 ... 23
• 2-3. 루푸스의 병인 및 발병기전에 대한 연구현황 ... 24
• 2-4. 루푸스에서 자가항체 분비 형질세포(plasma cells)의 특성 연구현황 ... 25
• 2-5. 루푸스에서 follicular helper T (Tfh) 세포 표적치료의 필요성 ... 26
• 2-6. 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells; MSC)를 이용한 난치성 면역질환 치료제 개발연구 현황 ... 27
• 2-7. 루푸스를 대상으로 한 줄기세포치료제 연구개발 및 임상시험 현황 ... 29
• 2-8. 유전자 이입 줄기세포치료제 연구개발 현황 ... 30
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 32
• 3-1. C57BL/6 마우스의 골수유래 MSC의 표현형 확인 및 고유의 성능확인 ... 32
• 3-2. MSC에 도입할 유전자 클로닝 및 발현 검증 ... 32
• 3-3. CXCR5+ MSC 세포주의 CXCR5 발현 및 이주성 검증 ... 33
• 3-4. CXCR5+ MSC 세포주의 CXCR5 발현도 향상 및 이주성 검증 ... 33
• 3-5. sIL-21R-Fc의 Tfh , PC 분화 억제능 검증 ... 34
• 3-6. nMSC와 sIL-21R-Fc+ MSC 세포주의 면역세포 증식 및 분화 억제능 검증 ... 35
• 3-7. nMSC와 sIL-21R-Fc+ MSC 세포주의 CD4+ T세포 증식 및 분화 억제능 검증 ... 35
• 3-8. MSC 세포주의 B220+ B세포 증식 및 분화 억제능 검증 ... 36
• 3-9. 항원 자극된 정상 생쥐에서 si-MSC의 체액면역반응 억제효능 ... 37
• 3-10. MRL/lpr에서 si-MSC 효능 조사 ... 38
• 3-11. Sanroque 마우스 분석 ... 39
• 3-12. MSC 세포주의 관절염 모델 마우스에서 관절염 발병 억제능 검증 ... 43
• 3-13. 새로운 루푸스모델 발굴 및 발병기전 연구 ... 45
• 4. 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 53
• 4-1. 목표달성도 ... 53
• 4-2. 관련분야 기여도 ... 53
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 54
• 5-1. 연구개발 성과의 활용 방안 ... 54
• 5-2. 기대 효과 ... 54
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 55
• 7. 연구개발성과의 보안등급 ... 55
• 8. 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비 현황 ... 55
• 9. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 56
• 10. 연구개발과제의 대표적 연구실적 ... 58
• 11. 기타사항 ... 58
• 12. 참고문헌 ... 59
• 끝페이지 ... 62