보고서 정보
주관연구기관 |
전남대학교 Chonnam National University |
연구책임자 |
김철수
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2021-12 |
과제시작연도 |
2021 |
주관부처 |
농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 |
TRKO202200009330 |
과제고유번호 |
1395067318 |
사업명 |
차세대농작물신육종기술개발(R&D) |
DB 구축일자 |
2022-09-17
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키워드 |
내재해성.병 저항성.콩 유전자 편집.감수성 유전자.활성산소종 유전자.Abiotic stress tolerance.Disease resistance.Soybean gene editing.Susceptibility gene.Reactive oxygen species gene.
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초록
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연구개발 목표 및 내용
최종 목표
작물 재배환경 악화에 대한 작물의 생장과 발달 최적화를 위하여, 유관속 분화 조절, 세포벽 대사 조절, 활성산소종 대사 조절 및 프롤린 대사 조절 등 생육 스트레스 내성 관련 양적형질을 동시에 관여하는 유비퀴틴화 유전자와 프롤린 대사 관련 유전자의 편집 가위 기술을 이용, 내재해성 강화 콩 작물을 개발하고자 한다. 또한, 병원균에 감염된 콩 전사체 분석을 통해 병 감수성 유전자 후보군들을 대량으로 탐색하며, 타 식물감수성 유전자의 콩 ortholog 발굴 및 감수성 유전자 교정 식물 분석
연구개발 목표 및 내용
최종 목표
작물 재배환경 악화에 대한 작물의 생장과 발달 최적화를 위하여, 유관속 분화 조절, 세포벽 대사 조절, 활성산소종 대사 조절 및 프롤린 대사 조절 등 생육 스트레스 내성 관련 양적형질을 동시에 관여하는 유비퀴틴화 유전자와 프롤린 대사 관련 유전자의 편집 가위 기술을 이용, 내재해성 강화 콩 작물을 개발하고자 한다. 또한, 병원균에 감염된 콩 전사체 분석을 통해 병 감수성 유전자 후보군들을 대량으로 탐색하며, 타 식물감수성 유전자의 콩 ortholog 발굴 및 감수성 유전자 교정 식물 분석을 통한 육종 소재들을 발굴하고자 한다. 더불어 유전자 교정을 통한 병저항성 돌연변이 콩 계통을 확보하고자 한다.
전체 내용
■ GmBEH3 유전자 교정을 통한 가뭄 내성 콩 인델 돌연변이체 구축
· GmBEH3 유전자는 브라시노스테로이드 호르몬의 신호전달 전사인자이며, 암반응 하에서 하배축 신장을 조절함을 알 수 있었다.
· Cas9/GmBEH3-sgRNA construct를 이용, 염기서열 분석 결과, 2개체의 T2세대 콩인델 형질전환체들을 확보하였으며, 형질전환체들은 가뭄 내성이 유도 되어짐을 알 수 있었다. 따라서 GmBEH3는 가뭄스트레스에 대해 음성적 조절인자임을 알 수 있었다.
■ GmRZF1 유전자 교정을 통한 가뭄 내성 콩 돌연변이체 구축
· GmRZF1 유전자는 애기장대 AtRZF1 유전자와 세포 내 생화학적 기능이 유사함을 알 수 있었다. 즉 유비퀴틴화 실험을 수행한 결과, GmRZF1 단백질은 유비퀴틴 E3 ligase임을 알 수 있었다.
· Cas9/GmRZF1-sgRNA construct를 이용, 염기서열 분석 결과, 1개체의 T2세대 염기치환 콩 형질전환체를 확보하였으며, 그 형질전환체는 가뭄 내성이 강화되었다. 따라서 GmRZF1은 가뭄 스트레스와 ABA 반응에 대해 음성적 조절인자임을 알 수 있었다.
■ 유전체 교정을 위한 감수성 유전자원 선발을 위한 시스템 구축
· 유전체 교정 대상 유전자의 선발을 위한 콩-병원균 상호작용 시스템 확보와 이를 통한 대량의 유전자 선발 플랫폼을 개발하는 것이 중요하며, 본 과제에서는 콩(광안)과 세균갈색점무늬병(P. syringae pv. syrinae)간의 상호작용을 기반 구축을 위하여 P. syringae pv. syrinae B728a (PssB728a) 균주 (OD600=0.01)를 dipping inoculation 방법을 통하여 4주된 식물에 접종하고 접종 후 높은 상대 습도를 유지한 결과 접종 4일이 지나면서 눈에 보이는 병징을 잎의 앞면과 뒷면에서 뚜렷하게 관찰하고 표준평판법을 이용하여 측정한 결과 PssB728a균주가 광안 콩 잎에서 뚜렷하게 생장함을 확인하였다.
· 본 연구는 2차년도부터 형질전환 대상인 William82 식물에서도 같은 경향을 관찰함으로써 광안 및 william82와 P. syringae pv. syrinae B728a 간의 상호작용 연구를 이용한 감수성 유전자 선발 플랫폼을 개발하였다.
■ PssB728a가 접종된 광안콩 잎에서의 전사체분석을 통한 TARGET 유전자선발
· PssB728a (세균성갈색점무늬병)을 OD600=0.1 (약 108 cells/ml) 농도로 접종 후 5일째 된 Glycine max cv. 광안콩의 잎으로부터 total RNA를 분리하고 Illumina Hiseq으르 통하여 전사체를 분석함. 반복간 시료의 유사성이 높게 분석되었으며 병원균 감염후 2배이상 증가하거나 감소하는 유전자 중 p<0.05를 갖는 유전자 8,902개(증가) 및 7,786개(감소)를 선발하였다.
· 전사체분석을 통하여 병원균(PssB728a) 감염 후 영향을 받는 유전자군은 gene ontology 분석과 KEGG pathway enrichment 분석을 통하여 유전체 편집에 활용할 일군의 유전자를 선발하였다.
· 1단계 사업을 통하여 이들 유전자 중 Mitogen-activated protein kinase4 (Glyma.16G03670), RPM1-interacting protrin 4 (RIN4) homologs RIN4a (Glyma.03G084000), RIN4b (Glyma.16g090700), RIN4c (Glyma.18g166800), RIN4d (Glyma.08G349500)와 애기장대에서 알려진 SSI2 (SUPPRESSOR OF sa INSENSITIVITY2)와 상동성을 가지는 콩 Stearoyl-ACP desaturase (Glyma.02G138100)를 1단계 사업의 유전체 편집 대상 유전자로 선발하였다.
■ TARGET 유전자 교정을 위한 콩 형진전환 빛 형진전환체의 유전자 교정 분석
· MPK4, SSI2, RIN4a~4d 유전자 교정을 CRISPR RGEN tools (www. rgenome.net/cas-designer)과 CRISPR-PLANT (www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html)을 사용하여 CRISPR/Cas9 인식 부위인 PAM (protospacer adjacent motif) 5’-NGG-3’ 서열을 설정하고, DB에서 분석되어진 잠재적 영역에서 (1) translation inition codon에 가깝고, (2) PAM 서열을 제외하고 19-20 bp 길이이며, (3) 가능하다면 G로 시작하고 (4) PAM 서열 알페 A/G (R)가 위치하는 함으로써 Gx17RGG 형태가 표적위치가 되도록 선발하였다.
· 선발한 영역을 을 vector에 삽입하기 위하여 각 single-strand의 annealing을 통하여 double0-stranded DNA을 얻고 표준화된 golden gate cloning 방식을 이용하여 pGRNA 조합을 통하여 pEco201_pBAtC(RE_XbaI,PacI)-P-cas 에 최종적으로 삽입하여 본 연구에 사용하였다.
· 2021.10.1.일 현재 6개 유전자의 각 영역을 이용한 식물 형질전환 vector를 기 제조하여 형질전환에 사용하고 있으며, MPK4의 경우 다른 영역의 사용을 위하여 새롭게 제작하고 있다.
■ 유전자 교정을 위한 형질전환 수행 및 종자 확보
· 유전자 편집 돌연변이 콩 육성을 위해서 종자 선발 → 종자 가스 소독 → wet incubation → 종자 액체 소독 → 종자 침지 →Agrobacterium tumefaciens를 이용한 형질전환 → CCM 치상(공배양) → SIM (shoot-induction)1 치상(줄기유도) → SIM2 치상(줄기 유도 선발) → SEM (shoot elogation) 배지 치상 (1~4회 정도 반복 실시) →RM (rooting medium) 치상 (뿌리 유도) → 기내 순화 과정 → 온실 배양 및 종자 확보과정으로 진행되며 SIM2 배지에서부터 PPT를 첨가하고 기내 순화과정 전에 잎에 PPT를 painting하여 형질전환 벡터 삽입 여부를 재차 확인하였다.
· 대상 품종으로는 2020년도는 광안품종을 2021년도는 William 품종을 사용하여 형질전환을 수행하였다.
· 각 반복당 100-600개 정도의 종자를 사용하여 형질전환을 수행하였으며 형질전환체 획득에 실패한 경우도 있지만 꾸준하게 형질전환을 수행하고 있으며 본 연구진이 사용하고 있는 식물조직배양실과 LMO 1급 시설인 유리 온실에서 생육하고 있다.
■ 형질전환 및 유전자 교정 여부 분석
· 형질전환 여부를 확인하기 위하여 각 형질전환 T1 세대에 BASTA painting 법을 이용하여 저항성 여부를 확인하고 BASTA 유전자 특이적 primer를 이용하여 재차 확인하였다.
[광안-MPK4 형질전환체 분석]
· MPK4 형질전환체의 경우 그림 9에 있는 것처럼 4048 bp가 떨어진 두 개의 영역을 pEco201_pBAtC(RE_XbaI,PacI)-P-cas vector에 삽입하여 양 쪽 부위에서 유전자 절편의 deletion이 동시에 일어났는지를 확인하기 위하여 PCR을 이용하여 그 영역을 증폭하여 일차적으로 확인하였다.
· gRNA1~3영역에서 deletion이 일어나는 경우 gRNA3 및 gRNA1 영역의 근접부위에 위치하는 primer에 의한 amplicon이 크기는 약 409bp로 예상되는데 먼저 제조한 광안 형질전환체의 경우에서는 이 deletion이 나타나지 않았다.
· gRNA1 과 gRNA3 영역에서의 indel 가능성은 여전히 배제할 수 없어, 각 영역을 KAIST 연구진에서 제공하는 Indel frequency deep sequencing 준비하고 있다.
[광안-RIN4a 형질전환체 분석]
· RIN4a 형질전환체의 경우 그림 9에 있는 것처럼 두개의 서로 역방향으로 overlap이 되어진 두개의 gRNA 영역을 pEco201_pBAtC(RE_XbaI,PacI)-P-cas vector에 삽입하여 유전자 교정을 시도하였으며 6개의 형질전환체의 Indel frequancy를 확인한 결과 1번 개체의 경우 50.9%, 2번 개체의 경우 31.80%, 5번 개체의 경우 34.80%, 6번 개체의 경우 23.00%의 indel frequency를 보였으며 3번과 4번 개체의 경우 0.50 및 0.30 %를 보여 이 두 개체의 경우 유전자 교정이 일어나지 않은 것으로 판정된다.
■ 유전자 교정 식물의 세균갈색점무늬병에 대한 병저항성 반응 분석
· MPK#3에서 유래한 3개의 개체가 뚜렷하게 병징 생성이 억제됨을 보여 이후 연구에서 이 개체에서 유래한 T3 식물체의 유전자 편집 및 transfer DNA의 여부 등을 확인하고 다양한 병원균에 대한 병 저항성 여부를 분석할 예정이다.
· 애기장대 WS 생태형의 경우 RIN4 유전자의 이형접합형의 경우 병원균 감염에 대하여 증진된 저항성 반응을 보여 상당한 편집 효율을 보였던 #1, #5번 식물에서 병저항성 반응을 예상하였으나, #1의 경우 p=0.012로 감수성 반응을, #5의 경우 광안콩과 유사한 병징의 발생을 보였다.
· RIN4a #5에서 유래한 하나의 개체에서 뚜렷하게 병징 발생이 감소한 것으로 보여 이 특정 T2세대로부터 얻어진 T3 식물체의 유전자 편집 및 transfer DNA의 여부 등을 확인하고 다양한 병원균에 대한 병 저항성 여부를 분석할 예정이다.
연구개발성과
- GmBEH3 유전자는 암반응하에서 하배축 신장을 조절하는 브라시노스테로이드 호르몬의 신호전달 전사인자로서, Cas9/GmBEH3-sgRNA construct를 이용, 2개체의 T2세대 콩 인델 형질전환체들을 확보하였으며, 형질전환체들은 가뭄 내성이 유도되어졌다.
- GmRZF1 유전자는 유비퀴틴 E3 ligase 기능을 가진 효소로서. Cas9/GmRZF1-sgRNA construct를 이용, 1개체의 T2세대 염기치환 콩 형질전환체를 확보하였으며, 그 형질전환체는 가뭄 내성이 강화되었다.
- 유전자 교정 식물전달체 작성, 형질전환체 분석과 병저항성 반응까지의 전 연구공정을 확보하였다.
- 다양한 종류의 감수성 유전자 관련 후보 유전자들을 확보하였다.
연구개발성과 활용계획 및 기대 효과
- 프롤린 함량 조절 기술은 내건성 혹은 저온 내성을 증진 시키는 매우 중요한 기술이므로 생육 스트레스에 대한 여러 작물에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
- GmRZF1 ubiquitination 시스템과 GmBEH 인산화 재편 시스템에 따른 환경 스트레스 내성유도 네트워크 기술은 양적형질을 조절함으로 여러 타 경제작물에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
- CRISPR/Cas9 방법을 통한 유전자 교정 기술을 사용하여 콩 유전자 돌연변이체 작성과 동시에 그 적용방법을 표준화함으로써 콩 유전자 교정에 관한 플랫폼을 정립할 수 있다.
- 유전자 교정을 통한 돌연변이체 육성은 농업분야에서의 활용가능성이 다른 영역에 비하여 매우 높아 유전자 교정을 위한 유전자 소재 개발 및 이를 활용한 병저항성 우량 계통의 확보는 콩 자급력 증대 및 국내 시장 보호를 위해 중요할 것으로 기대된다.
(출처 : 요약문 2p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 요 약 문 ... 2
- 목차 ... 6
- 1. 연구개발과제의 개요 ... 7
- 1-1. 연구개발 목적 ... 7
- 1-2. 연구개발의 필요성 ... 7
- 1-3. 연구개발의 범위 ... 8
- 1-4. 연구개발의 목표 ... 9
- 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행내용 ... 11
- 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 43
- 3-1) 연구 수행 결과 ... 43
- 3-2) 목표 달성 수준 ... 56
- 4. 목표 미달 시 원인분석 ... 58
- 1) 목표 미달 원인(사유) 자체분석 내용 ... 58
- 2) 자체 보완활동 ... 58
- 3) 연구개발 과정의 성실성 ... 58
- 5. 연구개발성과 및 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 60
- 6. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 61
- 참고문헌 ... 63
- 끝페이지 ... 64
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