초록 ▼

연구개발 목표 및 내용
최종 목표
유전자교정기술은 일반적으로 특정 유전자좌에서 특이한 목표변이를 유도하는 기술로 알려져 있으나 이는 주로 녹아우를 만들거나 매우 제한된 특이 대립유전자를 만드는 목적으로 활용된다. 우리는 작물 자체가 갖는 유전자활성의 잠재력을 극대화시킨 돌연변이 라인을 확보하기 위해 유전자 특위적인 무작위 돌연변이 차세대 유전자교정 신기술 개발하고자 다음의 최종목표를 설정하였다.
1) Error-prone polymerase 기반 Crop evolution mutator (CRevoM) 기술 개발-M

연구개발 목표 및 내용
최종 목표
유전자교정기술은 일반적으로 특정 유전자좌에서 특이한 목표변이를 유도하는 기술로 알려져 있으나 이는 주로 녹아우를 만들거나 매우 제한된 특이 대립유전자를 만드는 목적으로 활용된다. 우리는 작물 자체가 갖는 유전자활성의 잠재력을 극대화시킨 돌연변이 라인을 확보하기 위해 유전자 특위적인 무작위 돌연변이 차세대 유전자교정 신기술 개발하고자 다음의 최종목표를 설정하였다.
1) Error-prone polymerase 기반 Crop evolution mutator (CRevoM) 기술 개발-Mobile polymerase mutator 테스트 및 활용
2) ABE 또는 CBE와 CrevoM 융합기술 개발-Mobile Base Editor 기술 개발
3) 유전자 특이적인 무작위 돌연변이를 위한 작물 농업 형질 분석 및 우수 라인 선별

전체내용
< 1차년 >
1) 유전자 특위적인 무작위 돌연변이를 위한 Error-prone polymerase 기반 Crop evolution mutator (CRevoM) 기술 개발하고자 1) CRevoM 바이오부품 (Error-prone polymerases) 확보하고 dCas9 및 polymerase의 결합모듈 (CRevoM)에 대해 그 변이유도 능력을 대장균에서 테스트 하였으며, 2) CRevoM 식물체에서 발현시키고 분석을 진행하였다.
2) 다양한 Base Editors (PmCDA, APOBEC3A, eveCDA 기반의 CBE 및 ABE7, ABE8e 및 ABE9e)가 그 활성과 Base substitution 능력에 대해 테스트 되었으면 목록은 다음과 같다.
- Cytidine Base Editor 테스트
·nCas9-PmCDA-1xUGI 테스트
·evoCDA-nCas9-2xUGI 테스트
·APOBEC3A-nCas9-2텨햐 테스트
- Adenine Base Editor 테스트
·ABE7-nCas9 테스트
·ABE8e-nCas9 테스트
·ABE9e-nCas9 테스트
3) Virus 및 식물 기반의 식물 및 미생물 shuttle promoters 활용 CRISPR/Cas omponents 분석 시스템 구축이 구축되었으며 특기사항은 다음과 같다.
- Long 35S 프로모터/35S-terminator: Base Editor 발현용
- AtU6 프로모터: gRNA발현용
4) 병저항성 유전자의 유전자 교정이 이루어졌으며 그 유전자는 다음과 같다.
- MLO1 유전자의 녹아우트 제조
- PELO 유전자의 녹아우트 제조
< 2차년 >
1) Fusion Base Editors 개발을 위해 constucts가 제조되고 테스트 되었다.
2) Mobile Base Editor 시스템 구축 및 테스트을 위해 constucts가 제조되고 테스트 되었다.
3) 1차년도 제조된 유전자교정작물의 형질전환체 세대 증식 및 그 형질이 분석되었다. 유전자교정을 통해 확보된 형질전환체 계대 및 대량 증식 유지 관리되었고 확보된 형질전환체의 다양한 농업형질이 분석되었다.

연구개발성과
○ 다양한 Base Editors의 확보 및 프로모터에 따른 genome editing window 확인하였다.
○ Polymerase 기반의 모바일 시스템과 개발된 Base Editor를 결합한 targeted mobile Base Editor 시스템을 개발하였다.
○ 부농종묘에서 제공된 BN85, BN86 육성계통을 활용하여 흰가루병 저항성 및 토마토황화잎말림병 저항성 유전자교정 토마토라인을 확보하였다.
○ HybProbe melting 방법을 활용하여 SlMlo1 유전자에 mutation된 2종의 형질전환체를 확인하였다.
○ HybProbe melting 방법을 활용하여 Pelo 유전자에 mutation된 1종의 형질전환체를 확인하였다.

연구개발성과 활용계획 및 기대 효과
○ Mobile mutator 기술은 돌연변이를 특정 유전자 또는 특정 유전자의 도메인에 유도하되, 디자인되지 않고 식물의 DNA repair mechanism 동안 생산되는 모든 대립유전자의 활용 가능성을 열어두는 육종기술로 활용 잠재력이 매우 크다고 판단된다.
○ 최신의 유전자가위 기반의 유전체교정은 정밀 디자인 육종에 집중되어 있어 정밀육종 기술과 돌연변이 육종기술의 융합을 통한 mobile mutator 기술의 개발 분야는 블루오션 영역에 있다.
○ 특허 출원 및 등록을 통한 지적 재산권 확보가 가능하다.
○ 고유 우량 엘리트 유전자원 확보를 위한 플랫폼기술로 활용가능할 것이다.

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 요 약 문 ... 2
• 목차 ... 5
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
• 1-1. 연구개발의 개요 ... 6
• 1-2. 연구개발 대상 기술의 국내외 현황 ... 7
• 1-3. 연구개발의 중요성 ... 8
• 1-4. 연구개발의 목표 및 내용 ... 10
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행내용 ... 12
• 가. 연구개발과제의 배경 ... 12
• 나. 연구 수행 과정 및 내용 ... 15
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 17
• 1) 연구 수행 결과 ... 17
• 2) 목표 달성 수준 ... 41
• 4. 목표 미달 시 원인분석 ... 42
• 1) 목표 미달 원인(사유) 자체분석 내용 ... 42
• 2) 자체 보완활동 ... 42
• 3) 연구개발 과정의 성실성 ... 42
• 5. 연구개발성과 및 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 42
• 6. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 42
• 참고문헌 ... 43
• <붙임 1> 주요 결과 요약서 ... 45
• 끝페이지 ... 48