초록 ▼

연구개발 목표 및 내용
최종 목표
고추에서 유전자 교정 시스템 체계 구축하고 이를 활용하여 가지과 작물 과색 관련 유전자의 기능 연구 및 육종 소재를 개발하고자 한다. 고추에서 Capsicum 속에 특화된 유전자 교정 시스템 체계를 통해 가지과 작물의 과색 유전자의 기능 연구와 육종 소재를 활용하여 고기능성 고추 품종을 개발에 기여한다. 식물 RNA 바이러스 시스템을 이용하여 유전자 가위를 활용한 고추 특화 유전자 교정 기반 기술 개발한다. 또한 Cas9 유전자가 형질전환된 고추 개발 및 선발하여 실험에 사용될 식물 재료

연구개발 목표 및 내용
최종 목표
고추에서 유전자 교정 시스템 체계 구축하고 이를 활용하여 가지과 작물 과색 관련 유전자의 기능 연구 및 육종 소재를 개발하고자 한다. 고추에서 Capsicum 속에 특화된 유전자 교정 시스템 체계를 통해 가지과 작물의 과색 유전자의 기능 연구와 육종 소재를 활용하여 고기능성 고추 품종을 개발에 기여한다. 식물 RNA 바이러스 시스템을 이용하여 유전자 가위를 활용한 고추 특화 유전자 교정 기반 기술 개발한다. 또한 Cas9 유전자가 형질전환된 고추 개발 및 선발하여 실험에 사용될 식물 재료를 얻는다.

전체 내용
Cas9이 도입된 고추 형질전환체 개발 및 viral 벡터 기반의 유전자 가위 전달 기술구축과 과색 유전자에 대한 연구를 진행한다. 주관연구개발과제에서는 유전자 교정을 비롯한 다양한 방법을 사용하여 고기능성 고추 품종 육성을 위한 과색 유전자의 연구를 수행하며, 공동연구개발기관(서울대)는 고추에 감염하는 식물 RNA 바이러스를 이용하여 gRNA 발현 벡터와 Cas9 단백질과 gRNA를 동시에 발현 가능한 벡터를 제작하여 유전자 교정 기술을 구축하고 유전자 교정 효율을 검정한다. 공동연구개발기관 (㈜ 툴젠) 과제에서는 Cas9이 형질전환된 고추를 제작 및 선발하여 유전자 교정에 사용될 식물 재료를 제작한다.

연구개발성과
고추의 주황색 성숙과를 결정하는 유전자인 Zeaxantin epoxidase(ZEP)에 대한 대장균에서의 color complementation assay를 이용하여 돌연변이 ZEP 유전자가 주황색 결정에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다. 또한, ZEP 유전자에 대하여 VIGS 기법을 통해 발현을 억제할 경우 노란색 과실이 주황색 과실로 나타남을 확인하였다. 가지과에서 과색과 관련된 중요 유전자인 PRR2와 PSY1 유전자에 대한 유전자 교정 기술을 이용한 기능 연구를 수행하였다.
가지과 작물의 색소체 발달에 관여하는 PRR2의 기능 연구를 위해 다양한 품종의 토마토에 대해 유전형과 표현형에 대한 characterization을 수행하였으며 PRR2, PSY1 각각 그리고 PSY1과 PRR2를 타겟하는 sgRNA와 Cas9이 삽입된 E0 형질전환체 개발하였다. 가지과 작물에서의 TRV-delivery를 활용한 genome eiditing system을 구축하였다. Cas9 과발현 담배와 토마토 형질전환체 개발 후 유전자 편집기술의 효율 증대를 위해 gRNA에 Mobile sgRNA를 추가하였다. 이를 통해 TRV를 접종한 담배의 다음 세대에서 유전자 편집 개체를 확보하였다.
고추 RNA 바이러스인 오이모자이크바이러스(CMV) 감염 클론을 기반으로 하여 CMV RNA3 plasmid에 PDS gRNA 발현용 벡터를 제작하였고 CMV 바이러스 감염성 플라스미드 벡터중 RNA1을 이용하여 Cas9 단백질 발현용 고추 RNA 바이러스 벡터 construct를 구축하였다. Cas9 발현용 CMV RNA1과 PDS gRNA 발현용 CMV RNA3를 각각 Agrobacterium을 이용하여 해당 클론을 식물에 감염, Cas9과 gRNA 발현 효율을 검정하였다. Cas9 발현용 CMV RNA1과 PDS gRNA 발현용 CMV RNA3를 co-infiltration 하여 각 유전자의 발현효율을 확인 및 PDS editing 여부를 확인하였다. 주관연구개발기관과의 연계연구를 통해 제공 받은 Cas9 과발현 형질전환 담배에 PDS gRNA 발현용 CMV RNA3 클론을 접종하고 CMV RNA3-5'gRNA 클론에 의한 PDS editing을 제한효소 처리를 통해 확인하였다. 고추식물로의 CMV 벡터 적용을 위하여 CMV 대한 고추 품종별 바이러스 감수성 및 저항성 특징 분석 완료하였다.
고추 형질전환 시스템 구축하기 위해 4개 서로 다른 형질전환 방법 조건을 사용하면서 최상의 조건 확립하였다. 자엽에서 형질 전환하여 캘러스 유도, 재분화 유도를 하였으며 2년간 약 3만립의 고추 종자 사용하였다(제공처: 농우바이오; 그전에 형질전환이 잘 되었던 계통들임). 일주일에 종자 400개 형질전환이 가능한 시스템을 구축하였다. 고추 형질전환을 위한 벡터는 Cas9 over-expression cambia 벡터, Cas9::GFP over-expression cambia 벡터 등을 제작하였으며 GFP 발현으로 형질전환 세포를 추적하고자 하였다. 고추의 캘러스 상태에서 GFP 발현 구현 및 캘러스 상태에서 Cas9, GFP PCR 밴드 확인하였고 GFP 발현 캘로스에서 Cas9 삽입 신초 1점을 확보하였다.

연구개발성과 활용계획 및 기대 효과
고추는 형질전환이 어려운 작물로 고추에서의 효율적인 유전자 교정 기술 개발을 통해 다양한 유전자의 reverse genetic 분석이 가능해질 것이라 기대한다. 효율적인 유전자 교정 시스템을 구축하기 위해 식물 RNA 바이러스를 이용한 viral 벡터 기반의 유전자 가위 전달 기술을 개발하고 Cas9이 형질 전환된 고추를 개발 및 제공하여 기존 방법보다 쉽고 빠른 형질전환이 가능해 과색 관련 유전자 기능 연구 등에 활용할 수 있다. 차세대 유전자 교정 기술구축을 통해 지적 재산권을 확보하고 이를 통한 부가가치 창출이 가능해질 것이다.
고추 과색을 나타내는 카로티노이드는 항산화, 눈 건강, 심혈관질환 개선에 효과가 있으며 특히 고추에서 활성이 높고 축적이 많이 된다고 알려져 있다. 과색 유전자의 기능 연구를 통해 고기능성 카로티노이드 성분 및 함량을 조절 가능하게 하는데 기여할 것이다.
본 과제에서 도입된 유전자 교정 기술을 활용하여 개발된 품종이 성공적으로 시장에 진입 할 경우 향후 다양한 고추 품종 육성 분야에 적용 가능할 것으로 기대되며 소비자 기호형 고기능성 물질 함량을 조절할 수 있는 품종을 개발하여 새로운 품종 시장을 개척할 수 있을 것으로 기대한다.

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 요 약 문 ... 2
• 목차 ... 5
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
• 제1절 연구개발 목표 및 개요 ... 6
• 제2절 연구개발의 필요성 ... 7
• 제3절 연구 개발의 창의성·혁신성 등 ... 9
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행내용 ... 10
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 14
• 1) 연구수행 결과 ... 14
• 2) 목표 달성 수준 ... 59
• 4. 목표 미달 시 원인분석 ... 61
• 1) 목표 미달 원인(사유) 자체분석 내용 ... 61
• 2) 자체 보완 활동 ... 61
• 3) 연구개발 과정의 성실성 ... 61
• 5. 연구개발성과 및 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 63
• 6. 연구개발성과의 관리와 활용 계획 ... 64
• <붙임 1> 주요 결과 요약서 ... 66
• <붙임 2> 참고문헌 ... 69
• 끝페이지 ... 71