초록 ▼

□ 연구개발 목표 및 내용
○ 최종 목표
기능성 성분이 강화된 십자화과 작물 육종 소재 개발
- 기능성 성분 생합성 연관 유전자편집 십자화가 개체 선발
- 기능성 성분 고함량 유전자편집 개체 선발

○ 전체 내용
○ 유전자편집 기술 개발
- 브로콜리/양배추의 글루코라파닌 생합성에 관여하는 MYB28 유전자와 글루코라파닌 분해에 관여하는 AOP2 유전자를 목표 유전자로 선정하여 sgRNA 를 제작함.
- Cas9 단백질과 sgRNA를 활용한 RNP 유전자편집 기술 및 Agrobacte

□ 연구개발 목표 및 내용
○ 최종 목표
기능성 성분이 강화된 십자화과 작물 육종 소재 개발
- 기능성 성분 생합성 연관 유전자편집 십자화가 개체 선발
- 기능성 성분 고함량 유전자편집 개체 선발

○ 전체 내용
○ 유전자편집 기술 개발
- 브로콜리/양배추의 글루코라파닌 생합성에 관여하는 MYB28 유전자와 글루코라파닌 분해에 관여하는 AOP2 유전자를 목표 유전자로 선정하여 sgRNA 를 제작함.
- Cas9 단백질과 sgRNA를 활용한 RNP 유전자편집 기술 및 Agrobacterium과 CRISPR/Cas9 이 bunary vector 에 도입된 유전자편집용 construct를 활용한 유전자편집 기술을 개발함.
○ 브로콜리/양배추 재분화기술 개발
- 브로콜리/양배추에서 분리된 원형질체에서 callus, shoot, root를 유도하는데 적합한 배지 조성과 처리 조건을 확인함.
- 브로콜리/양배추에서 stem explant 에서 callus, shoot, root를 유도하는데 적합한 배지 조성과 처리 조건을 확인함.
○ 유전자편집 기술 적용
- 상기의 개발된 기술을 활용하여 브로콜리/양배추 원형질체와 explant를 대상으로 유전자편집 기술을 적용함.
- 브로콜리/양배추에서 분리한 원형질체를 대상으로 PEG 처리를 통해서 MYB28과 AOP2 유전자 편집을 적용함.
- 브로콜리/양배추 stem explants 에 MYB28과 AOP2 유전자 편집용 binary vector에 형질전환된 Agrobacterium을 접종하여 유전자편집을 실시함.
- 유전자편집 실시 후 확보된 재분화된 조건을 적용하여 유전자편집이 적용된 stem 유래의 explants 와 원형질체에 대해 재분화를 시도함.
- 재분화된 브로콜리/양배추 개체 (T₀)는 순화 처리 후 토양으로 정식됨
○ 유전자편집 개체(T₀) 형질전환 여부 분석
- 유전자편집 개체 개발에 상용된 항생제 마커(Basta) 를 선발할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 실시하여, Basta gene 에 해당하는 PCR 증폭산물이 확인되면 유전자편지용 벡터가 도입된 것으로 판단하여 확인된 개체를 GMO 포장에서 화분재배하면서 특성 평가와 T₁종자 채종을 실시함.
○ 유전자편집 개체(T₀) 유전자 편집 여부 분석
- 형질전환이 확인된 T₀ 유전자편집 개체 전체에 대한 유전자편집 여부를 확인하지는 않았지만, 일부 T₀ 유전자편집 개체를 대상으로 염기서열 분석을 실시하여 유전자편집 여부를 일부 확인하여, GMO 포장에서 재배된 개체에 대해서 특성 평가를 실시함.
○ 유전자편집 개체(T₀ ) 대상의 글루코라파닌 함량 분석
- 유전자편집이 확인된 T₀ 개체를 대상으로 글루코라파닌 함량 분석을 실시하였음.
- 화뢰/결구 형성에 오랜 시간이 걸리므로 잎 조직에서 글루코라파닌함량 분석을 실시하여 글루코라파닌 함량이 증가된 개체를 선발함.
○ 유전자편집 브로콜리 개체(T₀)에서 T₁ 종자 채종
- 상기에서 확보된 유전자 편집 T₀ 개체를 포장에 정식하여 영양생장이 충분히 이루어지도록 표준재배법을 적용하여 재배함.
- 영양생장이 완료되고 화뢰가 형성되기 시작하면 채종을 위한 준비를 시작함. 하절기에는 4℃ 저온창고에서 저온처리를 한 후 재배온실로옮겨 화아 형성을 유도하고, 동절기에는 별도의 저온처리 없이 재배포장에서 직접 화아 형성을 유도함.
- 화아가 형성되면 유전자편집에 사용된 유전자원에 따라서 적절한 뇌수분(Bud crossing 혹은 Bud selfing)을 실시하여, 종실 발달이 되는지 관찰하여, 최종적으로 발달된 종실을 수확하여, T₁ 종자를 채종함.
○ 유전자편집 양배추 개체(T₀) 에서 T₁ 종자 채종
- 상기에서 확보된 유전자 편집 T₀ 개체를 포장에 정식하여 영양생장이 충분히 이루어지도록 표준재배법을 적용하여 재배함.
- 영양생장이 완료되고 화뢰가 형성되기 시작하면 채종을 위한 준비를 시작함. 하절기에는 4℃ 저온창고에서 저온처리를 한후 재배온실로 옮겨 화아 형성을 유도하고, 동절기에는 별도의 저온처리 없이 재배포장에서 직접 화아 형성을 유도함.
- 화아가 형성되면 유전자편집에 사용된 유전자원에 따라서 적절한 뇌수분(Bud crossing 혹은 Bud selfing)을 실시하여, 종실 발달이 되는지 관찰하여, 최종적으로 발달된 종실을 수확하여, T₁ 종자를 채종함.
○ T₁ 종자 발아 후 T₁ 유전자편집 개체 선발
- 수확된 T₁ 종자의 1/2은 주관기관에서 항생제 배지에서 유전자편집개체를 선발하는 작업을 실시하고, 선발된 개체에 대해서는 유전자편집 여부 확인과, homo, hetero 라인 확인하는 작업을 실시함.
- 선발된 T₁ 유전자편집 개체는 GMO 포장에서 재배하면서 특성평가를 진행하고, 화뢰 및 결구가 수확되면, 글루코라파닌 정량분석이 실시됨.
○ 유전자편집 브로콜리 T₁ 개체 특성 평가
- 수확된 T₁ 종자의 1/2은 협동기관 자체적으로 재배 평가를 실시함.
즉 GMO 포장에서 화분 재배하면서 화뢰 형성 시기, 화뢰 입자 크기,화뢰 색상 등의 원예적 형질들을 분석하였음. 특성 평가 후 우수하다고 판단되어 선발된 개체에 대해서 유전자편집 여부와 글루코라파닌 함량 분석을 실시함.
○ 유전자편집 양배추 T₁ 개체 특성 평가
- 수확된 T₁ 종자의 1/2은 협동기관 자체적으로 재배 평가를 실시함.
즉 GMO 포장에서 화분 재배하면서 생육과정 전반에 걸쳐 입성, 초장,식물체 크기, 결구 특성, 숙기 등 그 원예적 특성을 분석하였음. 특성 평가 후 우수하다고 판단되어 선발된 개체에 대해서 유전자편집 여부와 글루코라파닌 함량 분석을 실시함.
○ 브로콜리 T₂ 종자 채종
- 선발 T₁ 개체 대상의 T₂ 종자 채종 실시
○ 소포자 배양을 통해 생산된 유전자 편집 개체 선발
- T₀ 변이체에서 추출한 소포자를 배양하면서 콜히친을 처리하여 MYB28/MYB28 혹은AOP2/AOP2 라인으로 고정시키는 작업을 병행 실시하여 단기간에 상기 유전자 변이가 고정된 라인을 조기에 확보하는 전략을 실시함.

□ 연구개발성과
○ 브로콜리 유전자편집 개체(T₀) 확보
- MYB28 - 60, AOP2 - 95
○ 양배추 유전자 편집 개체(T₀) 확보
- MYB28 - 4, AOP2 - 37
○ T₁ 종자 채종
- 확보된 브로콜리 MYB28 TO 개체 중 41 개체에서 T₁ 종자 채종 완료
- 확보된 브로콜리 AOP2 TO 개체 중 64 개체에서 T₁ 종자 채종 완료
- 확보된 양배추 MYB28 TO 개체 중에서 4개체에서 T₁ 종자 채종 완료
- 확보된 양배추 AOP2 TO 개체 중 28 개체에서 T₁ 종자 채종 완료
- 확보된 T₁ 종자 발아 후 포장 재배 실시
○ T₁ 편집체 선발
- 상기에서 확보된 브로콜리 T₁ 종자 스크리닝 실시(중)
- 상기에서 확보된 양배추 T₁ 종자 스크리닝 실시(중)
○ T₁ 편집체 포장 재배 및 특성 평가
- 상기에서 확보된 양배추/브로콜리 포장 재배 및 특성 평가 진행(중)
○ 글루라파닌 고함량 유전자편집체 선발
- 브로콜리 MYB28 유전자편집 개체(DNA free 편집체) - 1 개체 선발
- 양배추 AOP2 유전자편집 개체 - 5 개체 선발

□ 연구개발성과 활용계획 및 기대 효과
가. 기술적 측면
○ CRISPR/Cas9 기술을 접목한 최신 분자육종 기술을 적용하여 신품종 육성에 걸리는 시간을 획기적으로 단축함 (전통육종 시 10년 이상 소요, 본 과제를 통해 4-5년으로 육종연한 단축)
○ 육종 회사가 보유하고 있는 우수한 육종 계통들을 대상으로 본 기술을 적용하면, 각 계통들이 가지고 있는 장점을 그대로 보유 하면서 부족한 형질만 개량할 수 있으므로, 품종 육성에 걸리는 시각 단축과 더불어서 아주 우수한 품종 생산이 가능해짐
○ 기능성 성분 함량이 증가된 십자화과 품종 개발에 본 기술이 직접 적용될 뿐만 아니라, 기타 작물의 기능성 성분 함량 증대를 육종에 기반기술로 활용될 것을 기대함
○ 본 과제를 통해서 확립된 기능성분 함량증대 기술은 같은 십자화과 작물인 배추, 무, 콜라비, 케일과 같은 작물에도 적용이 가능하다고 판단함.
○ 향후, 국내외 특허출원/등록을 통한 지식재산권 선점 및 확보를 기대함

나. 경제적․산업적 측면
○ 이미 형성된 기존 시장과 별도로 특정 기능성 성분을 다량 함유한 고기능성 채소를 육성하므로 프리미엄 시장으로 불리는 신규 시장이 창출되어 수익성과 매출액 증대를 기대할 수 있음.
○ 따라서 기능성 함량이 풍부한 고기능성 품종을 통해 글로벌 시장으로 진출할 경우 매출 증대와 고가의 프리미엄 시장을 개척하여 관련 시장 전체를 확대하는 부수적 효과도 창출할 것으로 기대됨.
○ 고기능성 브로콜리/양배추 시장이 형성되면 소비자 수요가 증대하고, 이로 인해 브로콜리/양배추 재배 면적이 확대될 것으로 예상됨. 이렇게 되면 고수익 농작물 선택에 어려움을 겪고 있는 국내 농가에게 재배작물 확대의 기회를 제공하면서 재배 작물을 다양화를 추구해 농가에 안정적인 수익을 제공할 것으로 기대됨.
○ 개발된 육종 계통을 이용한 글루코라파닌 품종 육성을 통해서 국내 브로콜리/양배추 종자 시장을 장악한 일본계 종자를 대체하는 효과 유도
○ 항암성분이 우수한 것으로 알려진 브로콜리/양배추에서 기능성 성분의 함량을 크게 증가 할 수 있다면, 이와 연관된 건기식 소재 및 식품 소재산업의 활성화를 촉진함. 고기능성 브로콜리/양배추 작물의 부산물을 활용한 기능성 성분 농축제품 생산에 활용을 기대함
○ 현재 남미, 동남아 지역의 저가 시장에 수출되는 브로콜리/양배추 종자를 북미, 유럽, 일본 등의 프리미엄시장과 시장이 확대중인 인도 및 중국 시장 진출을 추진할 계획임.
○ 고기능성 신품종 개발 및 보급을 통한 국내 프리미엄 브로콜리/양배추 시장을 개척하여 재배 농작물 선택에 어려움을 겪는 국내 농가에게 고수익 작물 재배 기회를 제공함.

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 요 약 문 ... 2
• 목차 ... 7
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 8
• (1) 연구 개발 목적 ... 8
• (2) 연구개발 대상 기술의 국내외 현황 ... 8
• (3) 연구개발의 중요성 ... 10
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행내용 ... 11
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 45
• 1) 연구 수행 결과 ... 45
• 2) 목표 달성 수준 ... 57
• 4. 목표 미달 시 원인분석 ... 57
• 5. 연구개발성과 및 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 57
• 6. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 58
• 참고 문헌 ... 59
• 끝페이지 ... 61