[보고서]임상적중요성불명 특발혈구감소증 및 초기 골수형성이상증후군 환자들의 유전체 분석을 통한 골수형성이상증후군 발병 기전의 이해 및 발병 억제 전략 수립

이제환

[국가R&D연구보고서] 임상적중요성불명 특발혈구감소증 및 초기 골수형성이상증후군 환자들의 유전체 분석을 통한 골수형성이상증후군 발병 기전의 이해 및 발병 억제 전략 수립
Genome analysis of patients with idiopathic cytopenia of unknown significance and early stage of myelodysplastic syndrome to elucidate pathogenetic mechanisms associated with progression to myelodysplastic syndrome and to develop preventive strategies for the progression 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	울산대학교 University of Ulsan
연구책임자	이제환
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2021-11
과제시작연도	2020
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
연구관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO202200012320
과제고유번호	1711149108
사업명	개인기초연구(과기정통부)(R&D)
DB 구축일자	2022-10-13
키워드	임상적중요성불명 특발혈구감소증.골수형성이상증후군.차세대염기서열.후향적 실험군.전향적 실험군.idiopathic cytopenia of unknown significance.myelodysplastic syndrome.next generation sequencing.retrospective patients cohort.prospective patients cohort.

초록 ▼

ㅇ 연구개요
골수형성이상증후군(MDS)의 전암병변인 임상적중요성불명 특발혈구감소증(ICUS)의 유전체 분석을 통하여, 질병의 발병 원인 및 진행 예측을 위한 진단/예후예측 유전학적 표지자를 발굴하고자 함

ㅇ 연구 목표대비 연구결과
• 후향적/전향적 코호트 구축 및 임상자료 수집:
- ICUS (n=185), 저위험MDS (n=147)
- 환자의 임상적 특성과 분자유전학적 검사 결과의 상관관계 분석을 통한 질병진행 및 생존 등에 영향을 주는 인자를 확인
- Panel-based targeted sequencing을 이용한 임상 적용 플랫폼 구축
• 표적 차세대염기서열분석:
- 165개의 표적 유전자의 전체 코딩 부위를 표적으로 하는 주문제작 프로브 구축
- 분석툴 최적화 (다형성제거, 종양유전자변이 데이터베이스활용, 시퀀싱/매핑 오류 제거)
- 유전자 돌연변이 프로파일링 (유전자변이의 빈도 증가 및 클론성이질성의 심화가 질환의 진행과 밀접하게 연관)
• microRNA분석:
- 정상 대조군, ICUS, 저위험MDS환자 검체에서 유의미하게 발현의 차이를 나타내는 후보유전자군 확립
- miRNA biogenesis가 질병의 진행과 밀접한 연관이 있으며, 세포주기 및 세포증식억제를 야기할 수 있음을 규명
• 돌연변이유전자 기능연구
- 질병의 진행과 연관된 돌연변이 유전자의 direct mutagenesis clone을 구축하여 oncogene으로서의 가능성 규명

ㅇ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과 (연구개발결과의 중요성)
• 구축된 유전자패널을 이용하여 ICUS 진단 및 예후예측의 정확도 증가
• 돌연변이유전자의 임상적용을 위한 hereditary clinic 개소
- 대상환자 선정 기준 확립
- 표적 유전자의 hereditary genetic abberations 여부 확인
- 전향적으로 hereditary hematologic malignancy 환자 및 가족 코호트 구축
• 유전자변이 분석결과를 통해 확인된 변이 축적여부와 질병의 진행 가속도에 대한 상관성 제시
- 변이 클론의 확장을 적극적이고 신속하게 억제하는 신약 전략에 대한 근거 제시
- 변이 여부 및 축적 여부에 따른 치료 전략 고찰
• ICUS → 저위험MDS 진행 연관 유전자의 돌연변이 유무에 따른 치료 지침 제시
• 고령사회에서 노인인구에서 빈번하게 발견되는 질환을 조기에 진단할 수 있는 의료시스템 개발

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
1) 최종연구목표 ... 4
2) 연구필요성 ... 4
3) 연구가설 ... 4
4) 연구범위 ... 4
2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 4
3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 14
1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 14
2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 14
3) 목표 달성 수준 ... 14
4) 목표 미달 시 원인 분석 ... 14
4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 14
5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 15
6. 참고문헌 ... 15
[붙임1] 세부 정량적 연구개발성과 ... 16
[붙임2] 연구책임자 대표적 연구실적 및 증빙(요약문 및 사본) ... 20
끝페이지 ... 22

표/그림 (13)

표 질환군에 따른 MDS 연관 유전자변이의 개수
표 질환군에 따른 유전자변이의 빈도 및 비교. **, P < 0.001; *, 0.001 < P < 0.05
표 유전자 기능 분류에 따른 유전자변이의 분포. **, P < 0.001; *, 0.001 < P < 0.05
표 유전자 기능군에 따른 변이의 VAF 비교. DM, DNA methylation; SF, splicing factors; HM, histone modification; TF, transcription factors; ST, signal transduction
표 DDX41 유전자 돌연변이 plasmid의 발현확인 (A) mRNA(B)protein
표 DDX41 유전자 돌연변이 clony formation assay. 10일간 배양하여 형성된 colony의 형태적 변화
표 non-clonal ICUS (blue), CCUS (green), lower-risk MDS (yellow), higher-risk MDS (purple) 환자의 생존곡선
표 (A) non-clona ICUS, CCUS, lower-risk MDS 질환에 따른 임상적 특성 및 (B) CCUS, lower-risk MDS의 유전자변이의 특성
표 CCUS 환자의 전체생존율에 영향을 주는 인자 단변량분석
표 환자 특성과 질병에 따른 생존곡선 (A) non-clonal ICUS (purple), 진단시 혈색소 ≥9 g/dL인 CCUS (green), 진단시 혈색소 <9 g/dL인 CCUS (blue), lower-risk MDS (yellow) (B) non-clonal ICUS (purple), variant allele frequency (VAF) ≥10%인 CCUS (green), VAF <10%인 CCUS (blue), lower-risk MDS (yellow) (C) non-clonal ICUS (purple), DDX41 mutation이 있는 CCUS (green), DDX41 mutation이 없는 CCUS (blue), lower-risk MDS (yellow) (D) non-clonal ICUS (purple), SRSF2 mutation이 있는 CCUS (green), SRSF2 mutation이 없는 CCUS (blue), lower-risk MDS (yellow)
표 건강대조군과 LRMDS환자에 비해 ICUS 환자샘플에서 miRNA 발현이 증가되어 있음. (A)건강대조군, ICUS, LRMDS 환자 골수샘플에서의 miRNA 발현을 two-way hierarchical clustering 분석을 진행하여 다이어그램 으로 나타내었음. 561개의 miRNA 발현이 ICUS 샘플에서 높게 나타남. (B)4개의 논문을 참조하여 MDS샘플에서 증가된 것으로 알려진 4개의 miRNAs(miR-17, miR-133b, miR-654, 그리고 miR-143a)과 반대로 MDS샘플에 서 감소되어 있는 것으로 알려진 10개의 miRNAs(miR-146a, miR-326, miR-423, miR-636, miR-940, miR-1284, let-7e, miR-196a, miR-320a-5p, 그리고 miR-320a-3p)의 발현을 Q-PCR로 검증함(건강대조군: n=19, ICUS: n=20, LR/MDS: n=21)
표 ICUS 환자샘플에서 DICER 발현수준이 증가되어 있음. miRNA 생성과정에 중요한 유전자들인 DROSHA, DICER, 그리고 AGO2의 발현을 Q-PCR로 측정함(n=10, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)
표 AML세포주, HL-60 세포에서 DICER를 과발현 시켰을 때, 세포주기가 arrest되고 세포증식도 감소함. (A)DICER를 안정적으로 과발현하는 HL-60 세포주를 구축하여 DICER발현을 Q-PCR로 검증 함(n=3, *p<0.05). (B)CCK-8 assay를 수행하여 세포증식을 측정함(n=4, ***p<0.001). (C)PI시약으 로 염색한 후 유세포 분석을 통해 세포주기를 측정함. 세포주기 분석의 대표적인 히스토그램을 위에 표 시하였고, 각 세포주기의 세포 population을 아래 그래프로 표기함(n=4, *p<0.05, **p<0.01)

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