초록 ▼

ㅇ 연구개요
전사인자 Runt-related transcription factor 3(RUNX3)는 정상 세포가 암 줄기 세포로 진행되는 초기 과정을 차단하는 gatekeeper의 역할을 함으로써 세포 방어체계를 유지함. 이는 RUNX3가 산화적 스트레스에 대응하여 초기 단계에서 세포의 항상성을 유지하는 방어와 관련성이 깊음. NF-E2-related factor 2(NRF2)는 다양한 항산화 효소 발현을 조절하는 대표적인 항산화 전사인자임. 본 연구과제는 (1) RUNX3의 NRF2 전사인자임을 규명 (2) NRF2 발현 시

ㅇ 연구개요
전사인자 Runt-related transcription factor 3(RUNX3)는 정상 세포가 암 줄기 세포로 진행되는 초기 과정을 차단하는 gatekeeper의 역할을 함으로써 세포 방어체계를 유지함. 이는 RUNX3가 산화적 스트레스에 대응하여 초기 단계에서 세포의 항상성을 유지하는 방어와 관련성이 깊음. NF-E2-related factor 2(NRF2)는 다양한 항산화 효소 발현을 조절하는 대표적인 항산화 전사인자임. 본 연구과제는 (1) RUNX3의 NRF2 전사인자임을 규명 (2) NRF2 발현 시후성유전학적 조절 및 RUNX3와의 관련성 규명 (3) RUNX3-NRF2-산화적 스트레스-암화 (carcinogenesis) 조절 연관성을 규명하고자 함. 그러므로 RUNX3 활성화가 산화적 스트레스를 조절하여 암을 포함한 산화적 스트레스 관련 질환의 예방/치료로서의 가능성에 기여하고자 함.

ㅇ 연구 목표대비 연구결과
• 1차년도: RUNX3가 NRF2 전사인자임을 규명하기 위해 (1) 마일드 산화적 스트레스(40 μM H₂O₂)시 NRF2 전사 활성 및 발현 측정함. 이를 위해 pGL2-NRF2-Luciferase 플라즈미드를 이용하여 NRF2 5´-UTR 활성 및 qRT-PCR법과 western blot법으로 NRF2 발현 측정함. (2) NRF2 5´-UTR 부위에 RUNX3의 결합 및 결합 부위 검증함. 이를 위해 RUNX3 발현 WI-38 세포에서 ChIP-sequencing 분석법으로 확인함. (3) NRF2 5´-UTR 내 RUNX3의 결합 부위가 NRF2 발현에 핵심 부위임을 검증함. 이를 위해 wild type NRF2-luciferase와 mutated type NRF2(RUNX3 결합부위 치환)-luciferase 플라즈미드를 이용하여 NRF2 5´-UTR 부위 활성 및 CRISPER-CAS9 도입 세포(RUNX3의 NRF2 결합부위를 결손시킨 세포)를 이용하여 NRF2 발현 측정함. 또한 NRF2의 전사유도 시 RUNX3의 활성화 기전 연구를 위하여 (1) RUNX3의 아세틸화(활성화), 핵 내 존재 및 아세틸 RUNX3와 bromo domain 2(BRD2, RUNX3 결합 단백질) 상호작용을 Immunoprecipitation법과 western blot법으로 확인함. (2) siBRD2 세포 및 H460-ERT2-RUNX3(K94/R171, BRD2 부위에 결합하지 못하는 RUNX3) 세포에서 NRF2 발현 확인함.
• 2차년도:NRF2 발현이 후성 유전학적으로 DNA 메틸화에 의해 조절되는 연구로 (1) NRF2 전사 조절 부위 내 CpG (hypermethylation) 영역에 대해 methylation specific-PCR법 및 bisulfite sequencing법으로 확인함. (2) DNA 메틸화 효소 DNMTs와 DNA 탈메틸화 효소 TETs의 NRF2 전사 조절 부위에 결합유무 및 결합 부위를 ChIP-qPCR 법 및 ChIP-sequencing 분석법으로 확인함. (3) siDNMTs RNA 또는 siTETs RNA 세포에서 NRF2 발현을 quantitative RT-PCR 분석법으로 확인함. NRF2 발현이 후성 유전학적으로 히스톤 변형에 의해 조절되는 연구로 (1) 전사 촉진 작용의 후성유전학적 조절자인 히스톤 메틸화 효소 MLL1 및 표적 분자 H3K4Me3와 히스톤 아세틸화 효소 HAT 및 표적 분자 H3K9Ac 그리고 H3K4Ac의 NRF2 전사 조절 부위에 결합유무 측정함. (2) 전사 억제 작용의 후성유전학적 조절자인 히스톤 메틸화 효소 EZH2 및 표적 분자 H3K27Me3와 히스톤 탈아세틸화 효소 HDAC의 NRF2 전사 조절 부위에 결합유무 측정함. (3) siMLL1, siHAT, siEZH2, siHDAC RNA 세포에서 NRF2 발현 측정함. (4) RUNX3와 후성유전학적 조절자의 상호작용을 IP-WB법 및 proximal ligation assay로 측정함.
• 3차년도:RUNX3의 산화적 스트레스 손상 억제를 규명하기위해 (1) RUNX3+/+ MEF, RUNX3-/- MEF, RUNX3 발현 세포와 RUNX3 미발현 세포, H460-ERT2 세포, H460-ERT2-RUNX3 세포 및 shRUNX3, siDNMT, siTETs, siMLL1, siHAT, siEZH2, 및 siHDAC RNA 세포에서 활성 산소종 측정함. (2) 산화적 DNA 변형 염기 8-hydroxyguanin, 지질막 과산화 및 산화적 단백질 변형 측정함. (3) 암세포 증식 여부 확인함.

ㅇ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과 (연구개발결과의 중요성)
- 암 억제 단백질 RUNX3는 정상 세포가 암 줄기 세포로 진행되는 초기 과정을 차단하는 gatekeeper의 역할을 함으로써 세포 방어체계를 유지함. 본 연구에서 암 억제 단백질 RUNX3가 항산화 시스템의 전사인자로서 작용하여 초기 단계에서 산화적 스트레스에 대응하여 세포의 항상성을 유지하는 gatekeeper로서의 역할을 규명함은 암을 포함한 산화적 스트레스 관련 질환의 예방/치료제로서의 가능성을 제시하고 있음.
- 그동안 암 억제 단백질로 알려졌던 RUNX3의 새로운 기능 즉, 항산화 기능 역할을 밝힘으로서 국내 연구 수준을 한 단계 높임.
- RUNX3 증강물질을 산화적 스트레스 관련 질환의 치료 및 예방 전략에 있어 중요한 증거를 제시하여 임상에 활용가능성이 높음.
- 기술 및 지식 정보를 국제적 우수 학술지 및 학술대회에 발표함으로써 산화적 스트레스 관련분야에 선도적인 학술적 역량 발휘함.


(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 3
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 4
• (1) 연구의 최종목표 ... 4
• (2) 연구의 필요성 ... 4
• (3) 연구가설 및 도출 근거 ... 5
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 6
• (1) 연구방법 ... 6
• (2) 연구수행내용 ... 6
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 7
• 1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 7
• 2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 15
• 3) 목표 달성 수준 ... 15
• 4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 17
• 5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 17
• 6. 참고문헌 ... 18
• [붙임1] 세부 정량적 연구개발성과 ... 19
• [붙임2] 연구책임자 대표적 연구실적 및 증빙(요약문 및 사본) ... 20
• 끝페이지 ... 26